User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/23

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Introdução
A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por isso o método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.

Questões
Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (ex. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.
 * Que características deve ter um primer de PCR?


 * Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessárias; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico;

Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida com mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagem: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagem: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA;

Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA e não apenas de mRNA e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.


 * Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

É possível identificar mutações presentes no gene em questão recorrendo à técnica de PCR e posterior sequênciação. O procedimento experimental deve ser aplicado a cada um dos indivíduos da família para uma comparação final que permite, então, a identificação das mutações.

1) Amostra biológica: células da mucosa bucal – esfregaço -> hidrólise ácida das células.

2) Design dos primers que permitam amplificar a cadeia (PCR)

OLIGO                    start   len      tm       gc%   any          3'       rep           seq

LEFT PRIMER        118     20   58.82   50.00    4.00    1.00    10.00      CATATTCTGGAGACGCAGGA

RIGHT PRIMER       2112   20   59.67   45.00    7.00    3.00    11.00      TGCTCAAGGCCCTTCATAAT

3) PCR (temos falta de material): primer, segmento a amplificar, o q precisamos Material: Amostra de DNA; 2 primers (forward e reverse); Taq polimerase; Mix de dNTPs; Tampão; Água.

4) Purificação do DNA para “limpar” as sequências correspondentes aos primers

5) Design dos primers que permitam a sequenciação

OLIGO             start   len      tm       gc%   any     3'       rep           seq LEFT PRIMER        118     20   58.82   50.00    4.00    1.00    10.00      CATATTCTGGAGACGCAGGA

600-650

OLIGO           start   len      tm     gc%   any    3'  rep      seq LEFT PRIMER      1498   24   58.81   37.50  6.00  2.00 12.00 TGTACACATATTGACCAAATCAGG

1000-1200

OLIGO            start  len      tm     gc%   any    3'   rep       seq

LEFT PRIMER      1049   20   59.94   45.00  2.00  0.00 10.00 ATGGGACGCTTGATGTTTTC

1600-1800

OLIGO            start  len    tm     gc%   any    3'   rep      seq LEFT PRIMER       512   20   60.21   50.00  2.00  2.00 11.00 GGCATAAAAGTCAGGGCAGA

6) Sequenciação: É necessária a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (que é complementar à sequência de DNA), DNA polimerase (enzima) e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, T, C e G). À mistura também se adiciona outro tipo de nucleótidos, didesoxinucleótidos (ddNTP).

7) Análise de resultados – comparação dos resultados da sequenciação com a sequência referência (BLAST).


 * Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.


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