User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/16

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Introdução
As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing

Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing

Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.

Questões
É necessário a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (que é complementar à sequência de DNA), DNA polimerase (enzima) e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, T, C e G). À mistura também se adiciona outro tipo de nucleótidos, didesoxinucleótidos (ddNTP)
 * O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

A cadeia sequenciada é a 5'->3' e as cadeias obtidas na sequenciação serão iguais a esta. O primer a utilizar deve ser complementar da cadeia molde (3´->5´), dado que a polimerização ocorre de 5'->3'.
 * Que cadeia é sequenciada?

A síntese da cadeia não é continuada indefinitivamente pois a mistura contém pequenas quantidades de didesoxinucleótidos, que bloqueiam a elongação. Isto deve-se ao facto dos ddNTP terem um átomo de hidrogénio ligado ao carbono 3´, em vez de um grupo hidroxilo.
 * Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

A quantidade de dNTP é bastante maior do que a de ddNTP, o que leva a uma incorporação probabilística com vantagens dos dNTP, obtendo-se cadeias de diferentes comprimentos e com número considerável de nucleótidos.
 * Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

Podem existir problemas tanto ao nível da polimerização como ao nível da resoluação da electroforese. A capacidade de polimerizar fragmentos com mais de 350-400 nucleótidos é reduzida, o que é observado no electroferograma pela fraca intensidade dos picos. Além disto, os picos correspondentes aos fragmentos de menor e maior comprimento não têm uma boa resolução, porque na electroforese são devidamente delimitados.
 * Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?



Adicionando primers complementares a diferentes distâncias da cadeia. Quando na sequência estão porções desconhecidas, utiliza-se o final de uma cadeia polimerizada anteriormente para a construção do primer.
 * O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?


 * Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

T vermelho A verde G preto C azul

Ind. 1 - TCGTGTTCTATGATCATGAGGTCGCCG

Ind. 2 - TCGTGTTCTATGATC/GATGAGGTCGCCG -> heterozigotia

Para sequenciar o gene recorre-se a um procedimento semelhante ao analisado. Quanto à amostra biológica poderá ser de qualquer tecido uma vez que todas as células têm no genoma este gene. Para sequenciar o mRNA será necessário obter cDNA,uma vez que só este pode ser sequenciado e criar primers complementares ao mesmo. Quanto à amostra biológica o mais fácil será recolher uma amostra de sangue que contém as cálulas que expressam o gene em questão.
 * Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?


 * Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.


 * 1) Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?
 * 2) Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.


 * Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

Para pensar

 * Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?


 * Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?


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