User:Margarida Azevedo/Notebook/Margarida Azevedo/2010/03/23

{| width="800"
 * style="background-color: #EEE"|[[Image:owwnotebook_icon.png|128px]] Project name
 * style="background-color: #F2F2F2" align="center"|  |Main project page
 * style="background-color: #F2F2F2" align="center"|  |Main project page


 * colspan="2"|
 * colspan="2"|

Entry title
Que características deve ter um primer de PCR?
 * Questões

Tem de ter aproximadamente 20 nucleótidos e tem que ser complementar ao ínicio da sequência que queremos amplificar. Primer 5'-3' e primer 3'-5'. Tem extremidade 3' OH livre para a DNA polimerase poder iniciar sintese. Primers não devem ser complementares entre si (risco de ligação) e a temperatura óptima de actuação entre 50-60ºC.

Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

O processo de RT-PCR pode separar-se dois passos: o primeiro consiste na passagem de RNA mensageiro para cDNA e o segundo em amplificar o cDNA. No primeiro passo, o primer ideal é oligo-dT (conseguem ligar-se à sequência 3'polyA localizada na região 3' UTR que está presente na maioria dos mRNAs), quando apenas queremos focar-nos em mRNA's. Quando não pretendemos estudar uma região especifica/gene utilizamos random primer (o que diminui a optimização do processo e resulta na transcrição reversa tanto de mRNAs como de RNAs não codificantes). o primer de gene especifico, permite-nos obter um cDNA especifico que ja sabemos querer estudar dum mRNA único.

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Fazer RT-PCR da sequência,usando primer de gene específico, e comparar a sequência de DNA complementar com o gene da globina (DNA)no BLAST.

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Fazer PCR da sequência do gene da beta-blobina da Mariae dos pais e comparar com as sequências na base de dados. A partir de mRNA's da beta-globina dos pais e da Maria, fazer a tradução da sequência de forma a verificar se a proteína é afectada


 * }