User:Filipa Ribeiro C. Lucas/Notebook/Filipa Lucas/2010/05/18

Projecto de investigação:
1.Introdução 2.Objectivos 3.Estratégias

Nome do Projecto: Criado por: Filipa Lucas, Licenciatura em Ciências da Saúde Data: Maio de 2010

Introdução:
A transformação genética apoia-se na tecnologia do DNA recombinante que consiste na tecnologia de corte e costura de ácidos nucleicos utilizando enzimas de restrição e ligases. A obtenção de células modificadas faz-se através da incorporação e expressão de genes de um modo estável nas células-alvo. As enzimas de restrição são ferramentas base na tecnologia do DNA recombinante. A engenharia genética de plantas pressupõe i) a transformação genética e ii) a existência de um sistema de regeneração in vitro da célula modificada para obtenção de uma nova planta. A engenharia genética, que visa contribuir para o aumento da diversidade genética, mas de um modo muito dirigido, envolve a transferência de genes previamente seleccionados de um organismo para outro. Em cereais, os mais estudados e utilizados têm sido a eletroporação e a biolística. O maior problema da eletroporação é a utilização de protoplastos, pois a regeneração dos mesmos é difícil, e não atinge níveis adequados para utilização destas plantas em programas de melhoramento ou em outros estudos. A biolística pode ser aplicada em qualquer tipo de tecido vegetal, porém requer equipamento apropriado tendo custo elevado, e pode inserir um grande número de cópias do gene de interesse nas células vegetais, provocando problemas na inserção e regulação dos mesmos. A técnica via Agrobacterium tumefaciens tem sido muito utilizada em dicotiledôneas, sendo bastante vantajoso, visto que uma ou poucas cópias do transgene é inserida no DNA da planta. O conhecimento deste processo levou os melhoradores a tirarem partido dele, dando origem à tecnologia mais frequente para a obtenção de plantas transgénicas, ou organismos geneticamente modificados (OGMs). De forma sucinta, uma planta transgénica é aquela em que se inseriu um gene (ou mais) de forma artificial. A sequência genética inserida – transgene – pode ser oriunda de outra planta ou mesmo de seres vivos significativamente diferentes. Neste projecto será abordado o processo de transformação genética dos cereais, nomeadamente do arroz, de forma a enriquece-lo com vitamina A.

Objectivos:
Em 1º lugar, deve-se:

- Identificar claramente os objectivos para trabalhar com manipulação genética (se é para estudos fisiológicos ou bioquímicos ou para gerar variabilidade não obtida por métodos convencionais);

- Avaliar as possíveis consequências que estas plantas modificadas podem trazer ao ambiente antes de proceder a transformação genética;

- Identificar qual a técnica para transformar células vegetais e seleccionar uma técnica para regenerar, a partir de uma célula transformada, uma planta inteira  e escolher o tipo de vector mais adequado para a infecção e a regeneração;

- Avaliar a resistência ou suceptibilidade do tecido vegetal aos agentes selectivos; metodologia, como a temperatura devem ser cuidadosamente observados.

- A confirmação da ocorrência de transformação do tecido vegetal via A. tumefaciens deve ser feita com uma combinação de testes, como o teste GUS (beta-glucuronidase), testes com marcadores moleculares para detectar a presença do gene de interesse, e testes de expressão do transgene, para assegurar a seleção correta de linhagens transgênicas. Estes testes de expressão do transgene também devem ser aplicados na progênie destas plantas transformadas, para que seja confirmada a transformação estável do gene de interesse.

Assim, para pôr em prática a técnica de engenharia genética, têm que se efectuar diversos passos: 1.	Identificar o gene a transferir 2.    Isolar o gene de interesse 2.	Introduzir o gene 3.	Obter a expressão desse gene

Estratégias
1- Escolha do vector:

O gênero Agrobacterium pertence à família Rhizobiaceae, e possui diversas espécies, como: A. tumefaciens, que é o agente causal da doença conhecida como a galha da coroa ("crown gall"); A. rhizogenes, agente da síndrome da raiz em cabeleira ("hairy root"); A. rubi, que induz tumores nas partes aéreas da planta; A. vitis, que induz tumores somente em videiras e A. radiobacter que não é patogênica.

Dentre estas a A. tumefaciens, bactéria de solo, aeróbica, gran-negativa, induz a formação de tumores devido a expressão de genes localizados no TDNA, que é transferido para a célula vegetal. A virulência desta bactéria é causada pela presença, nas cepas patogênicas, de um plasmídeo de alto peso molecular (150-250 kb), chamado de Ti ("Tumor inducing"). Assim, o desenvolvimento de vetores baseados no sistema Agrobacterium requer que as bordas direita e esquerda sejam conservadas e que os genes de síntese de fito-hormonas sejam removidos do T-DNA. Dessa maneira, qualquer seqüência de DNA inserida entre as bordas do T-DNA pode ser transferida e integrada no genoma vegetal, sem afectar a regeneração de plantas.

Propriedades do plasmídeo:

Num plasmídeo podemos considerar: 1. O T-DNA que é o troço de DNA que será inserido no genoma da planta; 2. O T-DNA contêm os genes para a síntese das opinas (efeitos cancerígenos); 3.T-DNA é ladeado por um conjunto de 24 a 25 pb que têm um papel determinante na transferência. Qualquer modificação nesta zona interfere ou impede com a transferência; 4. No T-DNA foram encontrados genes que codificam enzimas do processo de produção de citocinina responsável pelo desenvolvimento dos tumores. No T-DNA do Ri-plasmídeo existem 4 genes rol (rol A, rol B, rol C e rol D) que induzem a formação de hairy roots. Embora o processo ainda não esteja muito claro parece que o efeito resulta do aumento da sensibilidade à auxina endógena das plantas. A região virulenta é a região que engloba os genes responsáveis pela excisão, transferência e integração do T-DNA do plasmídeo para o genoma das células da planta; 5. A região virulenta está fora do T-DNA e é um segmento de aproximadamente 40 kb; 6. A região que engloba os genes responsáveis pelo catabolismo das opinas, permite à Agrobacterium utilizar as opinas segregadas nos tumores. As opinas são segregadas pelas células transformadas para a região intercelular do tumor ou rizosfera das raízes onde a bactéria vive. Estes compostos não podem ser metabolizados pelas células da planta, mas servem de fonte de carbono e azoto à bactéria. Os genes que codificam para a síntese das opinas transportados por cada Ti ou Ri-plasmídeo determinam o tipo de opina produzido pelo tumor ou hairy roots. Uma estirpe que transporte uma sintetase específica para determinada opina no seu T-DNA também transporta os genes para a catálise dessa opina específica, algures no DNA do Ti ou Ri-plasmídeo, por isso, as estirpes de Agrobacterium também podem ser classificadas de acordo com o tipo de opina utilizada (Murray, 1993).

2- A transferência do gene de interesse:

A transferência mediada por Agrobacterium pode ser esquematizada nos seguintes passos: 1.	Retirar o T-DNA a uma estirpe de Agrobacterium que tenha Ti-plasmídeo; 2.	Introduzir T-DNA com o(s) gene(s) que se querem transferir para a planta, no qual se inclui um gene marcador; 3.	Por em cultura conjuntamente a bactéria com pedaços de planta (raízes, caules, folhas, …) e permitir que haja infecção; 4.	Regenerar a planta a partir de células transformadas com eliminação das não transformadas através de antibióticos (se o marcador utilizado for um gene de resistência a antibiótico, o cultivo num meio com o antibiótico elimina todos os organismos não transformados, ou seja, todos aqueles que não contenham o gene de resistência); 5.	Como genes marcadores utiliza-se, mais frequentemente, i) o gene neomicina fosfotransferase, que confere resistência à canamicina e antibióticos relacionados e ii) o beta-glucoronidase (GUS), cuja actividade consiste em decompor uma série de substratos do grupo da beta-glucoronase, o resultado pode ser facilmente medido por diversos métodos, fluorométricos, espectrofotométricos e histoquímicos; 6.	A primeira fase envolve manipulação molecular de DNA. Os genes existentes no Ti plasmídeo são removidos e substituídos pelos genes a introduzir na planta e que ocorrem numa sequência contínua de DNA. O Ti é removido através de enzimas de restrição apropriadas para cada extremidade, que são, também, utilizadas nas extremidades do troço de DNA que se quer introduzir. Esse pedaço de DNA conterá dois tipos de genes, os genes responsáveis pela característica que se pretende introduzir e um gene marcador. A ligação entre o pedaço de DNA a introduzir e o DNA do plasmídeo é realizada por ligases. Obtêm-se assim um plasmídeo com DNA recombinado. Seguidamente este plasmídeo deve ser reintroduzido numa estirpe de Agrobacterium adequada. Numa fase posterior a bactéria é cultivada juntamente com material vegetal, permitindo o processo de infecção usual.