User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching

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Descrição

 * Caderno de apoio às aulas de Biologia Molecular BIOMOL_LCS/2010


 * Propostas de resolução dos exercícios e trabalhos


 * Exemplo do formato do trabalho final

Notas

 * Para cada dia de aula TP, podem consultar a proposta de resolução dos exercícios.

Introdução
A Atrofia Muscular Espinal (SMA) é uma doença autossómica recessiva caracterizada pela degenerescência progressiva dos neurónios motores, com perda da função muscular e respiratória, sendo a principal causa de morte infantil hereditária. Apesar de ser considerada uma doença rara, 1 em 40 indivíduos são portadores da mutação causadora da doença e 1 em cada 6000 bebés nasce com a doença. Em termos moleculares esta doença é caracterizada por mutações do gene telomérico Survival Motor Neuron 1, SMN1. Em resultado de uma duplicação invertida do cromossoma 5, este gene derivou numa segunda cópia (SMN2), que se localiza perto do centrómero. Apesar o gene SMN2 não ser essencial (está ausente em 10% da população normal), todos os doentes de SMA apresentam pelo menos uma cópia deste gene. Os genes SMN1 e SMN2 são muito semelhantes diferindo numa transição silenciosa de um nucleotido no exão 7. Esta alteração induz a disrupção de uma sequência reguladora de splicing que resulta na exclusão do exão 7 em cerca de 75% dos transcritos produzidos pelo gene SMN2. Esta alteração faz com que apenas uma pequena fracção do mRNA sintetizado a partir do gene SMN2 dê origem a proteína funcional. Uma particularidade interessante desta doença é o facto de o grau de severidade dos sintomas dependerem do número de cópias do gene SMN2. Doentes que possuem três ou quatro cópias do gene centromérico desenvolvem formas mais suaves de SMA, manifestando a doença tardiamente e sobrevivendo até à idade adulta. Estão mesmo descritos casos de indivíduos totalmente assintomáticos que, para além da mutação do gene SMN1 causadora da doença, apresentam 5 a 8 cópias do gene SMN2.

Estas observações demonstram que o gene SMN2 é capaz de corrigir a causa da SMA, sendo apenas necessário aumentar os seus níveis de expressão.

Os níveis finais de expressão de um gene resultam do balanço das taxas de síntese e degradação do mRNA e proteína. A síntese de mRNA é essencialmente definida pela taxa de transcrição do gene, mas são processos pós-transcricionais que vão definir a taxa de degradação do mRNA e a sua eficiência de tradução. Estes acontecimentos são modulados por reguladores positivos e negativos (proteicos e microRNAs) que reconhecem sequências específicas no mRNA e se ligam a elas. A identificação de reguladores negativos da estabilidade e tradução do mRNA e dos seus locais de ligação abre as portas à inibição directa da sua acção pelo design de oligonucleótidos modificados, resultando expectávelmente no aumento dos níveis globais de expressão do gene em causa, uma abordagem que poderá ser usada no contexto da SMA para controlar a progressão da doença.

Objectivos
O objectivo deste projecto é a identificação de reguladores pós-transcricionais do gene SMN2 que possam representar novos alvos para a terapia da SMA através da modulação da sua interacção com o mRNA codifiado por este gene.

Para tal iremos criar um modelo celular que permita a identificação em larga escala destes reguladores, consistindo numa linha celular que exprese de forma estável um gene repórter (luciferase do pirilampo) a cuja sequência codificante foi ligado o 5'UTR ou o 3' UTR do mRNA do gene SMN2. Adicionalmente, a linha celular expressará um segundo gene (luciferase de renilla) que servirá de controlo interno permitindo a identificação das alterações de expressão dependentes da presença dos UTRs do mRNA do gene SMN2.

Esta linha celular permitirá o teste rápido de bibliotecas de compostos químicos ou RNAs de interferência e identificação de reguladores específicos do mRNA do gene SMN2, identificados pela alteração do rácio do sinal bioluminescente emitido pelo gene repórter e pelo gene de controlo interno.

Abordagem
1. Construção do vector repórter de base

O primeiro passo consistirá na criação de um vector repórter contendo a sequência codificante da luciferase de pirilampo que permita a clonagem fácil dos segmentos de interesse do mRNA do gene SMN2 a 5' e a 3'.

Para tal usaremos como base o vector de expressão eucariótico pCMV5, onde introduziremos a sequência codificante da luciferase isolada a partir do vector comercial pGLE3 com as enzimas HindIII e XbaI. Esta estratégia de clonagem irá introduzir a sequência da luciferase no meio do local de policlonagem do vector pCMV5, deixando a 5' locais de restrição SacI, EcoRI, BglII, KpnI, MluI, ClaI e HindIII; e a 3' locais de restrição XbaI, BamHI, XmaI e SmaI.



Para efectuar esta clonagem, ambos os vectores serão digeridos com as enzimas de restrição HindIII/XbaI, e a ligação dos fragmentos desejados será efectuada após a sua purificação por electroforese em gel de agarose. A reacção de ligação será transformada em bactérias seleccionadas com ampicilina e algumas colónias isoladas serão amplificadas, o plasmídeo purificado e a presença do insert será verificada por digestão com as enzimas BamHI e MluI.

2. Construção do vector com 5'UTR

O primeiro passo consistirá na amplificação por RT-PCR da sequência do 5'UTR do mRNA do gene SMN2 usando primers contendo locais de restrição MluI (ACGCGT) e HindIII (AAGCTT). (... continua)

3. Construção do vector com 3'UTR

O primeiro passo consistirá na amplificação por RTPCR da sequência do 3'UTR do mRNA do gene SMN2 usando primers contendo locais de restrição XbaI (TCTAGA) e BamHI (GGATCC). (... continua)

4. Construção do vector de controlo

5. Construção da linha celular estável

Conclusão

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