User:Ana Luisa Van Innis/Notebook/Caderno BioMol/2010/05/15

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Clonagem molecular

A utilização de enzimas de restrição e vectores de DNA permite criar moléculas de DNA recombinantes e cloná-las em bactérias.

As bactérias transformadas com uma única molécula de DNA plasmídeo podem ser isoladas em placas de petri graças ao gene de resistência presente no vector.,

Em seguida, podem ser multiplicadas em culturas líquidas de pequena, média ou grande escala e utilizadas como "fábricas" de DNA, de onde se pode purificar o vector plasmídico, separando-o do DNA genómico e proteínas bacterianas pelo método da lise alcalina.

Consultar página original das imagens

O DNA presente em cada colónia bacteriana pode ser analizado por digestão com enzimas de restrição, para confirmar que contém a sequência desejada.

O DNA assim purificado pode ser introduzido noutras células (por exemplo, em células humanas) para, por exemplo, expressar a proteína codificada pelo gene clonado.

1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

Se no ser humano uma celula apresenta duas copias de cada gene, o numero de genes que se pode extrair de uma pessoa é: 2 x 10^13= 20^13 cópias de um gene Se numa bacteria podemos conter 700 copias de um plasmídeo, então o número de genes que se pode extrair num litro de cultura de bactérias é: 1^3 x 700 x 5x10^9 = 35x10^4 copias de um gene

2. Considere os seguintes vectores:

2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique. Escolheria o vector B, pois este apresenta um promotor que é essencial à transcrição do gene da proteína que se pretende produzir.

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:

Escolheria o fragmento codificante da direita (Bam HI - Eco RI) pois, em primeiro lugar, como é possível a ligação dos fragmentos nas extremidades (ou seja é possível o emparelhamento das extremidades do fragmento com a zona de policlonagem) permite que este seja introduzido na zona de policlonagem do vector e assim ser transcrito. Em segundo lugar também é mais conveniente utilisar um fragmento codificante cuja as duas extremidades sejam reconhecidas por duas enzimas de restrição distintas de forma a evitar que os fragmentos se liguem ao vector de forma invertida, ou seja o gene fica na orientação errada.

3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.

3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? Para proceder a esta clonagem teria de usar a enzima de restrição Bam HI, pois como podemos ver na figura esta é capaz de cortar o fragmento de forma a que esta seja introduzido no vector. Contudo, não é possível assegurar que o fragmento seja introduzida na posição correcta para que haja expressão da proteína. Como vimos anteriormente, o facto das duas extremidades do fragmento serem cortadas com a mesma enzima de restrição faz com que estas possam emparelhar com o vector tanto no sentido correcto como no sentido invertido (extremidades iguais). Se ocorrer a inserção do fragmento no sentido invertido não haverá expressão da proteína.

3.2 Como procederia para resolver o problema?

Em primeiro teria de isolar as bacterias transformadas numa placa com antibiótico. Em seguida tratava as bacterias com as enzimas de restrição Eco RI e Kpn I e procedia a electroforese para distinguir quais as bactérias em que o fragmento foi inserido na posição correcta. No caso do fragmento ter sido inserido na direcção correcta vai aparecer uma banda com 800 pb(resultante da digestão com a enzima KpnI) e outra com 4500 bp(resultante da digestão com a enzima EcoRI) no gel de electroforese. No caso do fragmento estar invertido o gel de electroforese apresenta uma banda de 130pb e outra de 5500pb. Por último se o fragmento não foi introduzido o gel de electroforese apenas apresenta uma banda de 4700pb.

3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

A clonagem funcionou pois no gel de electroforese em que utilisou-se a enzima EcoRI e Kpn I obteve-se 2 fragmentos, um correspondente à digestão da Kpn I com aproximadamente 800 pb e outro correspondente à digestão com a enzima EcoRI com aproximadamente 4500pb.