User:Gaston Paris:Notebook/Deleciones CheY-LOV

{| width="800"
 * style="background-color: #cdde95;" align="center"|
 * style="background-color: #cdde95;" align="center"|




 * align="center" style="background-color: #e5edc8;" |

title=Search this Project


 * colspan="2" style="background-color: #F2F2F2;" align="right"|Customize your entry pages 
 * colspan="2"|
 * colspan="2"|
 * colspan="2"|

Construcción vector para deleción 1671
Estoy retomando las anotacione sporque sino me pierdo. El objetivo es construir dos vectores pK18mobSacB con insertos de deleción de LOV y 1671 pra construir doble y triples mutantes sobre la cepa B. abortus 2308 ΔCheY Ya construí el vector pK18mobSacB con ΔLOV, me falta el mismo vector con Δ1671. Para eso tengo amplificado y digerido con EcoRI el inserto Δ1671 y me falta clonar en pK18mobSacB.

Digestión pK18mobSacB con EcoRI
pK18mobSacB 10μL NeBuffer Eco 2μL EcoRI 2μL H2O 6μL

Incubo a 37°C. Agrego CIP.

Corro un gel de agarosa. No se ve nada. FRACASO!! Repito mañana.

Repetición. Digestión pK18mobSacB con EcoRI
Repito el protocolo de ayer de digestión y tratamiento con fosfatasa. Corro en un gel y purifico la banda por geneclean con sílica casera. Siembro 2 μL de 20 μL totales en un gel de agarosa.

Marcador: 1 kb ladder (Promega)

Ligación
Tomo el fragmento purificado y digerido con EcoRI, precipitado y seco.
 * Agrego 6 μL de H2O y resuspendo.
 * Agrego 2 μL del vector pK18mobSacB/EcoRI/CIP.
 * Agrego 1 μL de buffer ligasa 10X.
 * Agrego 1 μL ligasa Promega.

Lo dejo overnight en un baño de agua en el cuarto frío. Temp inicial 20°C.



Transformación y colony PCR
Al día siguiente de la ligación la temperatura del baño estaba a 12°C. Transforme DH5α competentes químicas con 5 μL de la ligación en 100 μL de células y plaquee todo en LB-Km25.

Hoy preparé una mix de colony PCR

Preparo la mix y alicuoto en 20 tubos de 0,2 ml. A cada tubo le pipeteo una colonia y largo en paralelo un tubo de vidrio con 6 ml de LB Km25.

La reacción de PCR la corro en el ciclador genius con los sig ciclos:
 * 95°C por 5 min
 * 35 ciclos de:
 * 95°C por 45 seg
 * 55°C por 30 seg
 * 72°C por 30 seg
 * 72°C por 5 min

Pongo a crecer los tubos del 1 al 8 a 37°C.