User:Ines Sofia Silva Vieira/Notebook/Bio Molec - caderno/2010/04/20

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TP5
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Procedimento experimental

1. Recolha da amostra - esfregaço de células da mucosa, sangue... a.	LEFT primer: CATATTCTGGAGACGCAGGA b.	RIGHT primer: TGCTCAAGGCCCTTCATAAT DNAtemplate, primers F e R, Taq pol, dNTPs, solução tampão e H20. a.	CATATTCTGGAGACGCAGGA (5’ → 3’) b.	TGTACACATATTGACCAAATCAGG (5’ → 3’) c.	ATGGGACGCTTGATGTTTTC (5’ → 3’) d.	GGCATAAAAGTCAGGGCAGA (5’ → 3’) DNA template, primers, DNA pol, dNTPs e ddNTPs.
 * 1) 2. Construção de primers com o auxílio do programa 'primer3'
 * 1) Estes primers podem ser usados uma vez que cobrem a área de interesse(onde está presente a mutação).
 * 2) 3. Lise dos eritrócitos para obtenção do DNA
 * 3) 4. Preparação da mix para o PCR:
 * 1) 5. PCR
 * 2) 6. Electroforese com produto de PCR para verificar se a reacção de PCR correu conforme o esperado.
 * 1) 7. Purificação do DNA sequenciado para remover as sequências de primers.
 * 2) 8. Desenhar primers para a região mutada:
 * 1) 9. Mix para sequenciação:
 * 1) 10. Comparar os resultados obtidos com a sequência de uma base de dados(BLAST)

Este procedimento deve ser aplicado tanto aos pais como à própria Maria para que sejam identificadas (após comparação)as mutações.

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Para estudar a expressão do gene partindo do mRNA de cada individuo, é possivel obter cDNA pela acção da transcriptase reversa (RT-PCR).O cDNA é analisado posteriormente quanto ao tamanho e composição da sequência sendo então por fim comparada com sequências sem mutação

RNA, MgCl2, dNTPs, transcriptase reversa, solução tampáo, Água e primers. (de seguida trata-se de uma reacção semelhante à anterior) LEFT primer: TCTGTCCACTCCTGATGCTG RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC
 * 1) 1. recolha da amostra biológica
 * 2) 2. lise dos eritrócitos para obtenção do RNA
 * 3) 3. Construção dos primers para RT PCR
 * 4) 4. mix para RT PCR:
 * 1) 5. design de primers
 * 1) 6.Realização de PCR (água, cDNA, TAQpol, primers, solução tampão, dNTPs)
 * 2) 7. electroforese
 * 3) 8. análise da sequenciação e comparação com a sequência dos pais e a sequência do BLAST
 * 4) 9. apresentação de resultados


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