User:Iolanda S. O. Santos/Notebook/Caderno de Apontamentos/2010/03/23

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 * Exercícios TP4

Questões

Que características deve ter um primer de PCR?.

Primer (~20 nucleotidos); complementar do trecho da cadeia de DNA a ser amplificada; primers 5' - 3' e primers 3' - 5'; tem extremidade 3'OH livre para a DNA polimerase poder iniciar a síntese; Primers não deve ser complementares entre si; Temperatura optima de actuação (ligação ao DNA cadeia simples) deve ser 50-60°C.

Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

RT-PCR pode separar-se em 2 passos: 1 - passagem de mRNA a cDNA e 2 - amplificação do cDNA.

No primeiro passo utilizamos como primers os oligo dT que se ligam à sequência 3' polyA localizada na região 3' UTR, que está presente na maioria dos mRNA's, quando apenas queremos focar-nos nos mRNA's. Quando não pretendemos estudar um gene/região específica ou pretendemos uma visão mais alargada de outros genes utilizamos random primer que se ligam tanto a mRNA's como RNA's não codificantes (intrões + exões). Quando queremos obter a sequência de um gene específico, utilizamos os primers específicos de gene que se ligam ao mRNA (transcrito do gene de interesse e não a outros mRNAs transcritos de outros genes).

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Fazer RT-PCR da sequência usando primer especifico do gene da beta-globina e comparar a sequência de cDNA com o gene da globina(DNA) na base de dados (BLAST).

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Fazer PCR da sequência contendo o gene da globina afectado (dos pais e da maria), comparar as sequências dos três e com a sequência na base de dados. A partir de mRNA's da beta globina dos pais e da maria, fazer a tradução da sequência de forma a ver se há implicações na sequecia de aa da proteina gerada.


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