IGEM:Peking/2007/Switch:Miller

Day 1
1. 检查要用的试剂是否量够：
 * D medium（一次活化、二次活化、稀释和空白对照要用）；
 * Z buffer（配比时要用）；
 * 氯仿、0.1%SDS（裂菌时要用）；
 * 4mg/ml ONPG（反应物）；
 * 1mM Na2CO3（终止反应要用）
 * 如果有不够的，赶紧配好，灭菌或滤菌；

2. 灭菌：短试管（不带试管帽）；
 * Tube（离心用）；
 * 锥形瓶（二次活化maybe会用到）；
 * 带刻度试管（稀释时量取D medium用）；
 * 枪头：大枪头（用的较多，多多益善啦），中枪头（用的不多，1-2盒吧），小枪头（诱导时可能会用到，当然超净台里应该会有的^__^）
 * 50ml塑料离心管（稀释时用到，根据实验需要看灭多少吧）

3. 挑MG1655划线扳子的单菌落到装有1ml D medium的试管中，一次活化摇菌过夜；

Day 2
1:100稀释到新的试管中，诱导组加IPTG（final concentration=1mM），二次活化摇菌到OD600=0.28—0.7（这次实验摇到了0.41，约4个半小时）；如果二次活化体积过大，应选用100ml锥形瓶；（快诱导好的时候就可以准备要拿到王博那做实验的东西啦~）

4.	试管和做稀释用的50ml离心管放在冰中，使细菌停止生长；

5.	按所需比例用D medium稀释菌液；

6.	分光光度计测量稀释后的OD600，如过测量不准，则根据稀释倍数计算即可；


 * 拿着东西赶紧跑到生技楼王忆平老师实验室：

试管、tube、tube架（也可用王博那的）、菌液、1ml和200ml的微量移液器、大中枪头、试管架至少两个、timer、D medium（分装出一些配空白对照时用）、Z buffer、氯仿、01% SDS、4mg/ml ONPG、1mM Na2CO3.

7.	打开水浴，调节水温到28度，如果温度过高可用冰调节，取冰地点见下面提示；

8.	摆好试管，将菌液和Z buffer按照所需配比混合，每管总体积为2ml，空白组每种配比做两管，用D medium与Z buffer混合，；

9.	每管加入200ul氯仿和100ul 0.1% SDS，vertex 10s，28度水浴5min；

10.	每管加入400ul 4mg/ml ONPG，从加入第一管开始计时，每隔10s加入下一管，每加入一管立即vertex混匀，加下一管的同时将上一管放入28度水浴开始反应，开始反应时间为t0+10s；（t0可以事先就根据准备加入反应液的顺序写好的）

11.	待溶液出现足够的黄色，加入1ml Na2CO3终止反应，记录此时的时间t，反应时间即为[t-(t0+10)]s；

12.	将试管内的液体倒入tube，做好标记后，13000rpm离心3min，

13.	吸上清到事先洗好的比色杯中，测量OD550、OD420；

14.	按照公式 Unit=[(OD420-1.75*OD550)/t*v*OD600]*1000计算半β- 乳糖甘酶的活性单位.

王博那的分光光度计的使用方法
1：打开开关，在分光光度计背面；

2：等待机子启动完毕，出现下面页面：
 * Fixed
 * Scan

3：按向下移动键，选择Scan，按enter键，出现下面页面：

4：需要调节三项：

5：将比色杯放入样品槽，其中空白为右上角和1号样品槽，其他依次放入；（注意： 右上交的空白组光面朝自己，1-7号光面朝两侧，观察好光路不要放错. ）

6：按Zero键，机子根据空白参比调零，到页面下方waiting字样消失即可；

7：按Run键，机子开始测量1-7号样品的OD550、OD420，并依次出现显示屏上，可等测量完毕，依从上行键依次记录结果；

8：第二批样品加入后，如未换空白组样品，则不需要重新调零，结果会从8-…显示，8号即为1号空白样品，依次类推，不要记错实验结果；

9：按Stop键停止反应，如不需要保存实验结果，不用按save results键，直接按Home键回到主页，取出比色杯，关掉电源即可；

10：比色杯用蒸馏水清洗干净，卫生纸上控干.

提示
1：生计楼地下一层有制冰机，可以去那里取冰以调节水浴温度；

2：水浴旁边要准备好vertex，调节到touch模式，方面实验操作；

3：反应时，可打开分光光度计开关，启动需要一段时间，启动完毕后调节响应选项；

4：离心的时候准备好比色杯；

5：测量之前，用擦镜纸将比色杯光面两测擦拭干净.