User:Gaston Paris:Notebook/Clonado LOV

{| width="800"
 * style="background-color: #cdde95;" align="center"|
 * style="background-color: #cdde95;" align="center"|




 * align="center" style="background-color: #e5edc8;" |

title=Search this Project

=Objetivo= Clonar el gen de Brucella abortus LOV en el vector pTrcHisB (Invitrogen) en sitios de restricción diferentes. Se considera el ORF anotado en genoma de B. abortus
 * colspan="2" style="background-color: #F2F2F2;" align="right"|Customize your entry pages 
 * colspan="2"|
 * colspan="2"|
 * colspan="2"|

Jueves 09/08/2007
PCR con oligos BaLOVFullBam, BaLOVFullNhe, FullLOV-ReverseXhoI y StopLOVHind. Como templado se utiliza gDNA de B. abortus 2308.

La PCR se corrió en la cicladora genius con los siguientes ciclos:

5 min 94°C

35 ciclos de: 30 seg 94°C

1 min 55°C

1 min 72°C

final: 10 min 72°C



Viernes 10/08/2007
Precipitación de las PCRs

Se adicionaron 100 &mu;l de agua cada tubo y se extrajeron con cloroformo.

El DNA se precipitó con isopropanol y se seco.

Lunes 13/08/2007
Digestión de las PCRs y el vector pTrcHisB para ligar.

Las PCRs se resuspenden en 14 &mu;l de agua y se les adiciona 2 &mu;l de NEBuffer 10X adecuado, 2 &mu;l de BSA10X y 1 &mu;l de cada una de las enzimas indicadas.

Tomé 5 &mu;l del plásmido pTrcHisB (Qiagen) y las digerí en las mismas condiciones que las PCRs.

La digestión quedo toda la noche a 37°C

Miércoles 15/08/2007
Corrí un gel de agarosa con las digestiones y corté las bandas. La guardé a 4°C toda la noche.

Jueves 16/08/2007
Procesé los bloques de agarosa con el kit Illustra GFX (GE). La banda superior corresponde a 2 &mu;l del pTHB digerido con las enzimas que se indican en la leyenda y la banda inferior al fragmento de PCR con las mismas enzimas. - Cuantificación por el programa del documentador:

Guardo los tubos a -20°C hasta mañana



Miércoles 22/08/07
3hs a 16°C en baño de agua.

Miércoles 12/09/07
Transforme células competentes de DH5&alpha;F'Iq con 2,5 &mu;L de la ligación del 22/08/07. Plaqueo 200 &mu;l.

Jueves 13/09/07
Vinieron colonias en todas las placas. Colony PCR de 5 colonias de cada placa

La reacción se incubó en Genius con el siguiente ciclado: 5 min a 94°C seguido de 35 ciclos de 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 72°C 1 min. Finalmente se agregaron 10 min a 72°C. 10 &mu;l de cada reacción se corrieron en el gel de la derecha.

Se tomaron dos clones positivos para preparar las minipreps: N-H 1 y 2, N-X 1 y 3, B-H 1 y 2; B-X 2 y 4. Se crecieron en LB durante toda la noche. 

Viernes 14/09/07


Minipreps con 6 ml de cultivo utilizando el kit QIAspin (QIAGEN). Luego de eluir con 50 &mu;l de elution buffer se corrió 1 &mu;l en un gel de agarosa para cuantificar.

Corrí 1 &mu;l de cada ADN de la miniprep en un gel de agarosa. El resultado se muestra a la derecha. La cuantificación aproximada es de 100 ng/&mu;l de cada muestra. N-H: pTrcHisLOV NheI-HindIII, N-X: pTrcHisLOV NheI-XhoI, B-H: pTrcHisLOV BamHI-HindIII, B-X: pTrcHisLOV BamHI-XhoI.

Mande a secuenciar las muestras N-H 1, N-X 1, B-H 1 y B-X 2, con los oligos FORpTrcHisA, REVpTrcHisA y BALOV550. Los resultados estarán para el miércoles 19/09. 

Lunes 24/09/07
Analicé las secuencias que envíe y el resultado es el siguiente:
 * N-H 1: contiene una mutación que modifica un aminoácido. Enviar otro clon.
 * N-X 1: Está correcta en la zoma de lectura, faltan leer los extremos. Reenviar con oligos adecuados.
 * B-H 1: No salió la secuencia con el REVpTrcHisA. Reenvío con otro oligo y repetición secuencia REVpTrcHisA.
 * B-X 2: Tiene una base dudosa en la posición 590 aprox. Reenvío con oligo adecuado

Secuencias repetición:
 * B-H 1 con oligo LOV C69A Rev.
 * B-X 2 con oligo BaLOVFullBam.
 * N-X 1: con oligos LOV C69A Rev y REVpTrcHisA.
 * N-H 2: con oligos FORpTrcHisA, REVpTrcHisA, BALOV550 y LOV C69A Rev.

Jueves 27/09/07
Chequeo de la secuencia de los clonados:

BH1, OK

BX2, OK

NX1, falta secuencia entre 90 y 191 nt. Repetir con FORpTrcHisA.

NH2, falta secuencia entre 140 y 630 nt. Repetir con FORpTrcHisA y