User:Joana Vieira Fernandes/Notebook/Joana Fernandes/2010/05/04

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[edit] Vectores Os vectores de DNA permitem a replicação, transporte e/ou expressão de segmentos de DNA de interesse para células alvo. Os vectores mais frequentemente utilizados são vectores plasmídicos, moléculas de DNA circulares derivadas de sequências de DNA bacteriano extra-cromossómico e modificadas para incluir elementos genéticos de interesse.

1. Quais as características básicas que um vector plasmídico deve ter?

Um vector é uma molécula de DNA que deve dispor de várias características, de modo a permitir a clonagem de genes. Deve ser capaz de se replicar dentro da célula hospedeira e ser capaz de produzir numerosas cópias de DNA recombinante, sendo estas capazes de passar para as células filhas. Os vectores plasmídicos deve ser capazes de transportar um ou mais genes que lhes confiram propriedades particulares, tais como a resistência a certos antibióticos. Devem possuir pelo menos uma sequência de DNA que possa actuar como origem de replicação, de modo a que seja capaz de se multiplicar independentemente dos cromossomas bacterianos. Os plasmídeos mais pequenos aproveitam as enzimas de replicação de DNA da célula hospedeira de modo a fazerem cópias de si próprios, enquanto que alguns dos maiores transportam genes que codificam enzimas especiais e específicas para a replicação dos plasmídeos. Deve possuir um gene de resistência associado a um promotor que permite a selecção das bactérias na presença do antibiótico que causa à resistência (ex: rAMP) e ainda deve conter um local de (poli)clonagem, isto é, um local de reconhecimento onde as enzimas de restrição identificam e cortam o plasmideo permitindo a integração do gene em questão. Se não tiver esse local, o plasmídeo não pode ser aberto para a inserção de novos genes.

2. Os vectores podem ser representados pela sua sequência de DNA ou por mapas que incluem a indicação dos elementos mais relevantes presentes no vector.

Pesquise no google imagens dos vectores pUC, pGEX, pcDNA, pEGFP e o sistema pTre/pTet-On. Que diferentes características apresentam estes vectores e para que servem?

pUC: é um vector que contém a ORI, tem uma resistência para a ampicilina, um local de policlonagem e é utilizado para clonagem em bactérias.

pGEX: é um vector que contém a ORI, é utilizado para clonagem em bactérias. Contém o gene da lactose, o gene de resistência à ampicilina (rAMP), tem um local de policlonagem organizado por codões, tem a capacidade de produzir proteínas de fusão. Ao juntar o gene com a glutatião transferase (GST), faz com que a separação do produto pretendido seja muito mais fácil, através da utilização da trombina. Utiliza a enzima de restrição a BamHI.

pEGFP: contém a ORI, permite a clonagem em eucariotas, expressa o gene para a proteína fluorescente (EGFP). A zona de policlonagem está a montante do gene que expressa a proteína fluorescente, e a jusanto encontra-se o sinal de poli adenilação. Possui o promotor do citomegalovirus cMV (vírus de macaco) e permite introduzir um promotor que interessa, que vai regular a expressão da proteína fluorescente. Para isso, coloca-se o promotor e introduz-se o vector nas células eucarioticas, se o promotor for activado vai ocorrer a produção de EGFP.

pcDNA: é utilizado em células eucarióticas e em células de bactérias, possui o gene de resistência à ampicilina e à neomicina. Tem a capacidade e ser expresso em células humanos e ser seleccionado com antibióticos específicos. Possui uma variedade de enzimas na zona de policlonagem, que permite clonar muitos fragmentos de DNA com extremidades diferentes. Tem um sinal de poliadenilação de BGH. É um vector de expressão para células eucariotas, permite expressar proteínas diferentes sob o controlo de um promotor, que é o do cMV.

Sistema pTre/pTet-On: implica que o vector pode não estar a produzir nada, e ao fornecer um estimulo do plasmideo, o vector inicia o seu processo de transcrição e formação de mRNA.

3. De que forma é que um vector plasmídico é mantido na célula alvo?

O vector plasmídico é mantido na célula alvo devido à existência de fenómenos de selecção natural, como é o facto dsa expressão de genes de resistência a antibióticos. Em eucariotas o vector é mantido na célula por longos períodos de tempo se for incorporado no genoma. Se não estiver incorporado no genoma, quando a célula se divide o vector não se divide, ficando intacto numa das células filhas, e acaba por ser expelido.

4. Para além de vectores de DNA simples como os plasmídeos, podem-se construir vectores mais complexos com base em vírus, facilitando a entrada das sequências desejadas nas células alvo. Entre estes, os vectores retrovirais são muito utilizados por permitirem a integração estável do DNA no genoma da célula alvo. Se tivesse que construir um destes vectores, como faria para garantir que não há perigo de infecção e doença?

Para garantir que não há perigo de infecção e doença, é necessário retirar do genoma do vírus a parte responsável pelo estado infecciosos do vírus. Para isso, é apenas necessário manter as porções que são importantes para a entrada do genoma viral na célula, e a sua integração no genoma do hospedeiro. Deste modo, integra-se o fragmento que se pretende no genoma do hospedeiro sem que haja perigo de infecção ou doença.


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