User:Pablo E. Garcia Nieto

Contact Info



 * Pablo E. Garcia Nieto
 * UNAM-Genomic Sciences
 * Lindon B. Jhonson 112, Cuernavaca Morelos, Mexico
 * mail: pgarcia@lcg.unam.mx

I work in the iGEM's lab at UNAM-CCG.

Personal Info
I´m from Mexico city but actually live in Cuernavaca, Morelos, because I study at the the undergraduate program of genomic sciences at the Center of Genomic Sciences.

I love the idea of controlling machines to our benefit and I like to think the cell as a living mechine which we are beginning to fully understand it, and I`m doing my best effort to improve that understanding. For that I'm very atracted by synthetic biology, nanotechnology and biotechnology. However anything involved in biology is very exciting to me.

Hobbies

 * Romantic music(do not confuse with corny music).
 * Soccer.
 * Realism and heroic fantasy books.

Education

 * Bachillerato: Escuela Nacional Preaparatoria at UNAM
 * Student of the undergraduate program of Genomic Sciences at UNAM

iGEM-UNAM-Genomics 2011
We're a group composed of 13 students and 3 advisors who have a Bachelor's degree, both from the Program of Genomic Sciences at Universidad Nacional Autónoma de México, as well as one emotive instructor.

Project: Hydrobium etli
ABSTRACT

The bacteria Rhizobium etli occupies an important soil-enrichment, nitrogen-fixing niche in its symbiotic relationship with the common bean Phaseolus vulgaris. During its symbiotic stage, Rhizobium etli presents an adequate chemical environment for enzymatic hydrogen production. Although Rhizobium etli naturally produces hydrogen, it is through a low efficiency reaction. If more efficient hydrogen production is achieved, Rhizobium etli will acquire both the capacity of bioremediation via nitrogen fixation, as well as energy production.

Our central goal is to generate a transgenic Rhizobium etli, incorporating elements form the bacteria Clostridium acetobutylicum, the algae Chlamydomonas reinhardtii, and the bacteria Desulfovibrio africanus, in order to enhance hydrogen production to a utilizable threshold while preserving its nitrogen fixation and symbiotic capabilities. Currently, there are no alternatives combining both hydrogen and nitrogen pathways in a single organic and green chassis. As such, our system promises an eco-friendly alternative to chemically derived soil enrichment with hydrogen co-production.

Our aims are:


 * Hydrogen production through the design and implementation of a synthetic gene circuit.
 * Nitrogen fixation through an endogenous enzymatic pathway of our host chassis.
 * The creation of a self-sustained transgenic system capable of mild bioremediation and energy contributions.

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Protocols used
These are the protocols used by our team,in spanish. Miguel Ángel Ramírez et. al.

Extracción de ADN genómico
METODO

1. Inocular 5 ml de medio de cultivo con la cepa de interés e incubar 12 hrs a 300 rpm.

2. Centrifugar el cultivo a 10 000 rpm durante 1 min.

3. Resuspender la pastilla celular en 1 ml de TE 50:20, pH=8.0 con ayuda del vortex.

[El TE elimina cationes divalentes y lava el exceso de medio de cultivo].

4. Centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min y decantar el sobrenadante.

5. Resuspender la pastilla celular en 0.4 ml de TE 50:20 con la ayuda del vortex.

6. Adicionar 50 μl de SDS al 10% y 50 μl de proteinasa K a 2.5 mg/ml. Mezclar por inversión varias veces e incubar a 37 oC durante 1 hr.

[El SDS es un detergente que lisa la membrana bacteriana, mientras que la proteinasa K corta proteínas].

7. Transferir el lisado claro a una jeringa con aguja del No. 20 y hacerlo pasar a través de la aguja 5 veces.

8. Repetir la operación anterior pero esta ves usando una aguja del No. 25.

[Cuando se hace pasar la solución a través de las agujas se logra romper complejos macromoleculares en los que se encuentra atrapado el DNA. Con esta acción parte del DNA se rompe, aunque el daño no es suficiente para interferir con su análisis].

9. Adicionar 0.5 ml de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24:1) y mezclar con el vortex.

[Con esta operación se busca eliminar proteínas. El fenol desnaturaliza a las proteínas y probablemente disuelve proteínas desnaturalizadas. El cloroformo también contribuye a desnaturalizar proteínas además de que estabiliza la interfase entre la solución acuosa y el fenol. La mezcla fenol-clorofomo elimina el agua contenida en la fase orgánica. El alcohol isoamílico ayuda a la separación de la fase orgánica de la acuosa].

10. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min. Recuperar la fase acuosa y repetir la operación anterior 1 vez más.

11. Recuperar la fase acuosa y adicionar 2 volúmenes de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1).

[Con este paso se pretende eliminar al fenol debido a que oxida al DNA].

12. Recuperar la fase acuosa y adicionar 1/10 del volumen de acetato de potasio 3 M y 2 volúmenes de etanol absoluto. Mezclar con ayuda del vortex y centrifugar a 10 000 rpm y 4 oC durante 10 min.

[El DNA es insoluble en etanol y con la ayuda del acetato se favorece la precipitación de los ácidos nucleicos].

13. Retirar el sobrenadante y adicionar 1 ml de etanol al 70 %.

[Con el etanol al 70 % se lava el exceso de sal contenida en la muestra].

14. Resuspender con vortex y centrifugar 2 min a temp. ambiente. Repetir una vez más el lavado.

15. Retirar el sobrenadante y secar con ayuda del DNA speed vac.

16. Resuspender en 100 μl de TE-RNAsa (50 μg/ml) y analizar la preparación de DNA en un gel de agarosa al 1 %.

Extracción de ADN plásmidico
METODO

1. Inocular 3 ml de medio de cultivo con la cepa de interés e incubar 12 hrs a 37 oC y 300 rpm.

2. Transferir 1.5 ml del cultivo a un tubo eppendorf. Centrifugar a máxima velocidad (14 000 rpm) durante 1 min.

3. Decantar el sobrenadante y transferir el resto del cultivo al tubo eppendorf del paso anterior.

4. Repetir los pasos 2 y 3. Retirar totalmente el medio de cultivo. [El medio de cultivo deteriora la calidad de la preparación].

5. Resuspender la pastilla celular en 100 μl de Solución I (Glucosa/Tris/EDTA) con ayuda del vortex.

[Esta solución isotónica permite separar completamente a las bacterias, además de que contribuye a eliminar los iones divalentes presentes en el medio, mismos que son cofactores de muchas endonucleasas].

6. Adicionar 200 μl de Solución II (NaOH 0.2 N/SDS 1 %). Mezclar por inversión.

[El SDS (Dodecilsulfato de sodio) es un detergente que rompe las membranas bacterianas y desnaturaliza proteínas. El NaOH desnaturaliza al cromosoma y a los plásmidos].

7. Adicionar 150 μl de Solución III (CH3COOK 5 M, pH=4.8). Mezclar por inversión.

[El acetato neutraliza la solución y favorece el apareamiento de las cadenas de DNA anteriormente desnaturalizadas. Para el caso del DNA plasmídico, las hebras rápidamente se aparean y adquieren su configuración natural. En cuanto al DNA cromosomal, la renaturalización es muy ineficiente, lo que provoca que quede atrapado con los restos protéicos. Adicionalmente, el potasio forma complejos con el SDS que a su vez interaccionan con las proteínas formando precipitados en los que queda atrapado el DNA cromosomal].

8. Centrifugar a máxima velocidad a 4 oC durante 10 min.

[En este paso los complejos DNA cromosomal-proteínas precipitan, mientras que el DNA plasmídico permanece disuelto].

9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.

[Debido a que la concentración de DNA no es suficiente para saturar la solución, este permanece disuelto en el sobrenadante].

10. Adicionar al sobrenadante 1 ml de etanol al 100 %. Mezclar con ayuda del vortex.

[El DNA es insoluble en etanol, asi que en este paso se busca precipitarlo].

11. Refrigerar a - 20 oC durante 10 min.

[Ayuda a precipitar el DNA].

12. Centrifugar a maxima velocidad a 4 oC durante 10 min.

[Permite concentrar el DNA en una pastilla insoluble].

13. Retirar todo el sobrenadante con jeringa.

14. Adicionar 120 μl de agua y resuspender con ayuda del vortex.

15. Adicionar 15 μl de MgCl2 1 M. Mezclar con ayuda del vortex.

[Debido a que la preparación de DNA plasmídico esta contaminada con RNA, en este paso se busca eliminar al RNA formando un complejo insoluble con MgCl2].

16. Incubar en hielo durante 10 min y centrifugar a máxima velocidad.

17. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.

18. Adicionar 300 μl de etanol al 100 % y 15 μl de acetato de sodio 3 M. Mezclar con vortex.

[Como se menciono con anterioridad, el DNA es insoluble en alcohol y la presencia del acetato facilita la formación de un precipitado].

19. Refrigerar a - 20 oC durante 10 min.

20. Centrifugar a maxima velocidad a 4 oC durante 10 min.

21. Retirar el sobrenadante y adicionar 1 ml de etanol al 70 %.

[En este paso el acetato y otras sales presentes en la preparación son disueltas en el agua].

22. Resuspender con ayuda del vortex y centrifugar a temperatura ambiente a máxima velocidad durante 2 min.

23. Retirar el sobrenadante y secar con ayuda del DNA speed vac.

24. Resuspender en TE-RNAsa (50 μg/ml) y analizar la preparación de DNA en un gel de agarosa al 1 %.

Restricción
Una reacción típica para digerir entre 0.1 a 1 μg de ADN en un volumen final de 20 μl podría ser la siguiente:

- Llevar el DNA a digerir a 17 μl con agua ultrapurificada.

- Adicionar 2 μl del buffer apropiado (la concentración de los ¨buffers¨ es 10 X)

- Agregar 1μl de la enzima seleccionada. Generalmente la concentración de las enzimas esta dada en unidades. Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 μg de DNA en una hora.

- Incubar la reacción a la temperatura adecuada por una o dos horas.

- Dependiendo la enzima utilizada, la digestión puede detenerse incubando la reacción a una temperatura de 75 oC por 15 min. o adicionando 0.5 M de EDTA (pH8) a una concentración final de 10 mM.

Electroforesis en gel
METODO

1. Pesar la agarosa necesaria para preparar 100 ml de solución al porcentaje deseado.

2. Adicionar la agarosa a 100 ml del buffer de corrida.

3. Calentar la solución en el horno de microondas hasta que se funda la agarosa.

4. Vaciar la solución en el molde con el peine.

5. Dejar enfriar hasta que solidifique el gel.

Reacción de ligasa
METODO

A un tubo eppendorf se la adiciona:

DNA inserto 5 μl DNA vector 1 μl Buffer 10X 1 μl Agua HPLC 2 μl T4 ligasa 1 μl

Se incuba la reacción por 12 hrs a 14oC

Nota: La reacción de ligación de extremos cohesivos se lleva a cabo a una temperatura de 12o a 16oC para mantener un balance entre el alineamiento de los extremos cohesivos del DNA y la actividad de la enzima.

Conjugación bacteriana
METODO

∞Inocular por separado 5 ml de medio LB con las cepas donadora y receptora (para la donadora se adicionarán 150 mg de cloramfenicol).

∞Incubar los tubos a 37°C en agitación por 8-12 h.

∞Centrifugar las células bacterianas y lavarlas con la solución estéril de sulfato de Magnesio (10mM).

∞Resuspender con suavidad las células en 40 μl de la misma solución anterior.

∞Colocar por separado 10 μl de cada cepa en una caja Petri con medio LB y 10 μl de cada cepa en un mismo sitio de la misma caja.

∞Dejar secar.

∞Incubar por 12 h a 37 °C.

∞Colectar la población bacteriana, cruza y parentales con palillos de madera estériles y resuspender en 1 ml de solución estéril de Sulfato de Magnesio-Tween 40 (10mM- 0.01%).

∞Diluir la suspensión de la 10-1 a 10-5. Para ello, se tiene una serie de tubos con 900 μl de Sulfato de Magnesio-Tween. Del tubo donde de resuspendió la cruza se toman 100 μl y se añaden al primer tubo de la serie, se agita con vortex, se toman 100μl de este tubo y se añaden al segundo y así hasta completar las diluciones. este proceso se hace tambien con las células parentales, que serviran de control.

∞De cada dilución platear con triángulo de vidrio 50 μl por caja de LB con los antibióticos ácido nalidíxico (12 μg ml-1) y cloranfenicol (30 μg ml-1).

∞Incubar a 37°C por toda la noche.

Transformación bacteriana
METODO

Obtención de células competentes (para transformación con CaCl2).

1) Preparar tubos con 5 ml de medio LB e inocular cada uno con la cepa de interés. Agitar con el vortex e incubar durante toda la noche a 37o C.

[NOTA: Todo el manejo de cultivos debe hacerse en medio estéril].

2) Diluir los cultivos 100 veces en 50 ó 100 ml de LB y dejar crecer hasta una D.O. (λ=550 nm)=0.45-0.55.

[Experimentos varios sugieren que en E. coli la transformación es óptima cuando las células están en una fase tardía del crecimiento logarítmico].

3) Centrifugar durante10 min a 6000 rpm, a 4o C.

4) Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet (agitando con el vortex) en 20 ml de CaCl2 100 mM frío.

5) Mantener las muestras en hielo de 20 a 90 min (los resultados son mejores si se dejan durante 90 min).

6) Centrifugar durante10 min a 6000 rpm, a 4o C.

7)Disolver el pellet en 2 ml de CaCl2 100 mM frío.

[Se cree que los iones divalentes tienen al menos dos funciones en la transformación: i.)la formación de complejos de coordinación con los grupos fosfato del DNA y, ii )junto con las bajas temperaturas, favorecen un estado de transición de la membrana en que ésta se encuentra estática y semicristalizada, lo que permite que haya una mayor apertura o accesibilidad de los canales membranales].

8) Poner en tubos eppendorf alícuotas de 200 μl y añadir a cada una 100 μl de glicerol 40%.

9) Mezclar con vortex.

10) Guardar las muestras a -70o C.

Para checar que las células son competentes, transformar 200 μl de células con 50 ng de DNA circular y platear en medio adecuado.

Transformación.

1) Descongelar las células competentes en hielo.

2) Añadir a cada tubo, con 100 μl de células, 2 ó 3 μl de la ligación con que se desea transformar a las células. Dejar un tubo con sólo 50 μl de células sin DNA exógeno y darle el mismo tratamiento que al resto de las células (control).

3) Dejar reposar en hielo durante 20 min.

[Durante este tiempo, el DNA y las células competentes interactúan para lograr el establecimiento en el interior de la célula].

4) Dar un choque térmico durante 1 min a 42o C.

[Aunque este paso no es indispensable, se ha observado que aumenta la eficiencia en la transformación ya que permite que la membrana celular vuelva a tener movimiento y se cierren los canales de calcio (que se supone estaban expuestos)].

5) Pasar los tubos a hielo y mantenerlos ahí durante 5 min.

6) Añadir a cada tubo 1 ml de medio líquido LB.

7) Mantener los tubos durante 1 hr a 37o C (sin agitación).

[Durante este periodo de recuperación, las células retoman su actividad metabólica y nuevamente comienzan a sintetizar proteínas, incluyendo aquellas codificadas en el material genético recién adquirido].

8) Platear en cajas con el medio selectivo adecuado, 200 μl por caja. Platear también los 50 μl de células competentes que quedaron sin transformar, en el medio selectivo deseado y en LB, como control.

Lectura recomendada: Biol. 166: 557-580.
 * Hanahan, Douglas. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol.

PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacción en Cadena de la Polimerasa)
METODO

Lisis de colonias bacterianas.

1. Tomar con un palillo de madera una colonia bacteriana grande y resuspender en 200 μl de Tris-EDTA 10/1-NaCl 10 mM.

2. Calentar durante 10 min a 95 oC.

3. Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 min.

4. Tomar 10 μl como templado de DNA para el PCR. PCR.

1) Hacer la siguiente mezcla: Orden de adición Volumen

Agua desionizada 1 61.5 μl Buffer PCR 10X 2 10 μl dNTP’s (dATP, dTTP, 3 2μl c/u dGTP y dCTP) Enzima AmpliTAQ 4 0.5 μl

2) Adicionar a la mezcla anterior lo siguiente:

Prímero 5’ 5 5 μl Prímero 3’ 5 5 μl DNA 6 10 μl 100 μl/rxn

3) Evitando dejar gotas o restos de la mezcla sobre las paredes del tubo de PCR, poner 2 gotas de aceite mineral.

4) Utilizando un termociclador llevar a cabo la reacción de PCR:

Se harán 30 ciclos de amplificación, cada ciclo comprende las siguientes condiciones de temperatura:

- 94oC durante 1 minuto (desnaturalización del DNA templado) - 56oC durante 1 minuto (alineamiento de los prímeros) - 72oC durante 1 minuto (elongación de la cadena de DNA)

Habiendo concluido los ciclos, la reacción se mantiene a 4oC

5) El producto amplificado se corrobora a través de una electroforésis en gel de agarosa y tinción por Bromuro de etidio.

Reparación de extremos de ADN (blunting)
METODO

1. Mezclar los siguientes componentes en un tubo eppendorf:

H20 cbp 25 μl Buffer Blunting 10X 2.5 μl dNTP mix (1 mM) 2.5 μl DNA XX μl Blunt Enzime Mix 1 μl 25 μl

2. DNA cortado con enzimas de restricción, se incuban a temperatura ambiente durante 15 min.

DNA cortado mediante nebulización u obtenido mediante PCR, se incuban a temperatura ambiente durante 30 min.

3. Inactivar a 70 oC durante 10 min.

1. Preparación de medios de cultivo y antibióticos.

 * Medio PY.

Peptona de caseina 5 g/l

Extracto de levadura 3 g/l

Agar 15 g/l

Autoclavear a 120o C durante 20 min.

Agregar 1 ml de una solución de CaCl2 0,7 M por cada 100 ml de medio.

Solución de CaCl2 0,7 M

7.769 g de CaCl2 en 100 ml H2O

Autoclavear a 120o C durante 20 min.


 * Medio LB.

Extracto de levadura 5 g/l

Peptona de caseina 10 g/l

NaCl 10 g/l

Autoclavear a 120o C durante 20 min.

En caso de utilizar medios sólidos, se adicionan 15 g/l de agar bacteriológico

antes de esterilizar en la autoclave.


 * Preparación y esterilización de antibióticos.

Antibiótico Solución stock

Acido Nalidixico (Nal) 20 mg/ml de NaOH 0.1 M

Espectinomicina (Sp) 100 mg/ml de agua

Carbenicilina (Cb) 100 mg/ml de agua

Tetraciclina (Tc) 10 mg/ml de etanol al 70 %

Los antibióticos se esterilizan por filtración con membrana de 0.22 μ.

2. Preparación de buffers y reactivos varios.

 * 0.5 M EDTA pH8.

EDTA (disódico) 47.1 g

H2O Aforar a 250 ml

Ajustar el pH con NaOH, filtrar y esterilizar.


 * TE 50/20 pH8.

Solución stock Tris 1M pH8

Tris 30.28 g

H2O Aforar a 250 ml

Ajustar el pH con HCl, filtrar y esterilizar.

Solución stock EDTA 0.25 M pH8

EDTA (disódico) 23,55 g

H2O Aforar a 250 ml

Ajustar el pH con NaOH, filtrar y esterilizar.

TE 50/20 pH8

Tris 1 M 25 ml

EDTA 0.25 M 40 ml

H2O HPLC Aforar a 500 ml


 * TE 10/1 pH8.

Tris 1 M 5 ml

EDTA 0.25 M 2 ml

H2O HPLC Aforar a 500 ml


 * Tris-Boratos 5X.

Tris 53.89 g

Acido bórico 27.51g

EDTA (disódico) 3.72 g

H2O Aforar a 1 l


 * Buffer de cargado 6X.

0.25% de azul de bromofenol (bromophenol blue)

0.25% de xilen cianol (xylen cyanol FF)

15% Ficoll (tipo 400) en agua

Almacenar a temperatura ambiente.

3. Preparación de reactívos para extracción de DNA genómico.

 * Proteinasa K.

Disolver 5 mg de Pronasa en 1 ml de TE 50:20 y calentar 1 hr a 37 oC


 * RNAsa.

Disolver 30 mg de RNAsa en 1 ml de agua HPLC y calentar 10 min a 95 oC.


 * Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.

Mezclar 24 ml de Fenol, 24 ml de Cloroformo y 1 ml de alcohol isoamílico. Almacenar en frasco ambar a 4 oC.

4. Preparación de reactivos para extracción de DNA plasmídico.

 * SOLUCIONES.


 * TE-RNAsa.

5 μl de RNAsa a 10 mg/ml

1 ml de TE 10:1, pH=8.0

5. Preparación de reactivos para Conjugación.

 * Buffer MgSO4 10 mM.

MgSO4,7H2O 0,246 g

H2O Aforar a 100 ml


 * Buffer MgSO4 10 mM, Tween-40 0,01%.

MgSO4,7H2O 0,246 g

Tween-40 10 μl

H2O Aforar a 100 ml

6. Preparación de reactivos para Transformación.

 * CaCl2 100 mM.

CaCl2 1.11 g

H2O Aforar a 100 ml

7.Preparación de reactívos para Eckhardt horizontal.

 * N-Laurylsarcosina.

0.3 g de Sarcosil en 100 ml de agua. Guardar a 4oC.


 * Ficoll en TE 10/1.

2 g de ficoll (40,000 MW) en 10 ml de TE 10/1. Conservar a - 20oC en alícuotas de 1 ml


 * Solución de lisis.

0.4 mg/ml de RNAsa A en agua, hervida 10 minutos. Añadir 1 mg de Bromofenol por ml. Guardar a -20oC en alícuotas de 230 μl.


 * SDS en agua.

1 g de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) en 10 ml de agua. Añadir una pequeña cantidad de xilencianol (solo para darle coloración). Guardar a Temp. ambiente.


 * Lisozima.

1 mg de lisozima por 100 μl agua. Preparar al momento de uso.