User:Margarida Azevedo/Notebook/Margarida Azevedo/2010/03/16

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Exercício TP3
O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? Primer (20 nucleótidos), Dna polimerase, didNTP,4 dNTP, DNA (cadeia molde). Que cadeia é sequenciada? Cadeia complementar da cadeia molde usada.
 * Questões

Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação? O carbono 5' do dNTP a acrescentar liga-se ao carbono 3' no final da cadeia que permite a polimerização. Com a adição dos didNTP (não possuem o grupo OH 3'), a elongação é terminada. O nucleótido seguinte não consegue ligar-se à cadeia, isto é não há formação da ligação fosfodiéster. Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo? Os dNTPs são nucleótidos emparelhar e que possuem grupo OH 3', que permite a formação da ligação fosfodiéster do próximo nucleótido a acrecentar à cadeia.

Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? Problemas: os picos correspondentes ao mesmo nucleótido variam (altura e largura), mais para o fim da sequenciação os fragmentos são maiores, os nucleótidos são incorporados aleatoriamente e a DNA polimerase não consegue chegar tão longe; à medida que avançamos para 3' as intensidades vão diminuindo (esgotam-se os reagentes); sítios com N tornam a análise menos rigorosa A electroforese tem influência na separação dos picos (é mais fácil separar um fragmento de 100pb dum de 101 pb do que separar um de 500pb dum de 501 pb)

O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo? Partindo o fragmento a estudar em fragmentos de 600 a 1000 nucleótidos, usando endonucleases de restrição.

Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

Individuo 1- Individuo 2-TCGTGTTCTATGCTCATGAGAGTCGCCG (existe um pico que corresponde a 2 picos sobrepostos)

vermelho-t verde-a preto-g azul- c

Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder? Em relação ao DNA, é necessário produzir um primer complementar ao ínicio da cadeia para a podermos sequenciar. Em relação ao mRNA, poderíamos isolá-lo na célula, fazer transcrição reversa, obtendo DNA complementar, produzir um primer e sequenciar o DNA pelo método de Sanger.

Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo? Na região variável, os pais da Maria apresentam picos de cores diferentes, correspondentes a ddiferentes mutações ou polimorfismos. No electroferogama da Maria, pode-se observar os picos correspondentes à mtuação/polimorfismo do pai e mutação/polimorfismo da mãe.

Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique. Seria possível definir a sequência mas, sem comparação com os resultados dos pais, não saberíamos se teria ocorrido alguma mutação ou polimorfismo. Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

Para pensar Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?

Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano? Sequenciar dum lado e do outro e criar fragmentos sobreponíveis.


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