Etchevers:Extraction ARN francais

Protocole d'extraction des ARN (TISSUS)

Survol
Extraction de l’ARN total des tissus des vertébrés (dans notre cas, embryons de poulet/humain/souris) - jusqu'a 25 mg.

Materiels

 * Qiagen RNeasy Mini extraction kit (ref 74104) or Midi (75144)
 * ethanol 70% et 100%
 * azote liquide
 * mortier et pilon en agate (si petit, sertis dans un grand mortier)
 * proteinase K
 * cones avec filtres pour pipettes
 * tubes 1,5 ml microcentri en plastique sans RNase/DNase
 * tubes 15 ml style Falcon si grandes quantites

Avant de commencer

 * S’assurer que tout matériel et embouts nécessaires à la préparation des ARN est RNase-free.
 * Port de gants obligatoires.
 * Préparer la solution stock DNase I en dissolvant la DNase I solide (1500 unités kunitz) dans 550 µl d’eau RNase free fournie dans le kit. (attention à ne pas perdre de poudre de DNase I à l’ouverture du tube). Mélanger doucement par inversion du tube. NE PAS VORTEXER !!! Enfin aliquoter en tube de 20 µl et congeler à -20°C.
 * Rajouter 4 volumes d’éthanol (96-100%) au tampon RPE.
 * Préparer extemporanément de l’éthanol 70% : 14,7 ml d’éthanol 95% + 5,3 ml d’eau
 * Rajouter le b-ME au tampon RLT (10 µl de b-ME pour 1 ml de tampon RLT : 20 µL + 1980 µl pour un culot).
 * Laver la paillasse et les pipettes au RNAzap.
 * Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus.

Technique
Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT

1-	Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus.

2-	Laver le mortier à l'alcool et préparer de l'azote liquide.

3-	Introduire un peu d'azote liquide dans le tube contenant le tissu et renverser le tout dans le mortier pré-refroidi.

4-	Broyer le tissu doucement pour éviter les projections de tissus congelés et remettre de l'azote si le niveau baisse.

5-	Introduire 350ul à 2 ml de tampon RLT dans le mortier puis récupérer ces 2 ml après décongélation dans un tube de 2 ml.

6-	Passer le lysat tissulaire dans une colonne QIAshredder (3 fois 700 µl centrifuger 2 minutes à vitesse maximale ou tout en une fois).

7-	Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!). Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy

8-	Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml.

9-	Fermer le tube et centrifuger 5 min à 10 000 rpm.

10-	Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne. Etape 3 : Digestion à la DNase

11-	Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy.

12-	Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour laver la colonne.

(Pendant la centrifugation, ajouter 70 µl de tampon RDD à l'aliquot de 10 µl de DNase I préparée, garder sur glace).

13-	Eliminer l’éluat.

14-	Rajouter les 80 µl de la solution de DNase I (préparée pendant l’étape 12) dans la colonne (directement sur la membrane) et laisser en contact 15 min à température ambiante (20-30&deg;C) sur la paillasse.

15-	Ajouter (350µl) 2 ml du tampon RW1 sur la colonne RNeasy et laisser 5 min sur la paillasse.

16-	Centrifuger 2 min à vitesse maximum.

17-	Eliminer l’éluat. Etape 4 : Lavages

18-	Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube.

19-	Centrifuger 1 min à vitesse maximum (pour laver la colonne).

20-	Eliminer l’éluat.

21-	Ajouter une nouvelle fois (700µl) 2,5 ml de tampon RPE à la colonne RNeasy. Fermer le tube.

22-	Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute. Etape 5 : Elution

23-	Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml.

24-	Pipeter 30 µl d’eau RNase free et déposer directement sur la membrane de la colonne. Attendre au moins 1 min puis centrifuger pendant 1 minute à 700 rpm puis 2 min à vitesse maximum. On peut aussi y mettre que 10 µl, puis spin 1 minute, puis ajouter 20 µl, re-spin.

25-	Répéter l’élution de l’étape 26 avec une 2e volume de 30 µl d’eau RNase free, mais sans attendre. Cette 2e élution ne devrait plus avoir beaucoup d'ARN, sauf si la colonne est surchargée, en lequel cas on récupere beaucoup.

Contact
--Alethea 10:02, 14 December 2006 (EST)