User:Joana Vieira Fernandes/Notebook/Joana Fernandes/2010/04/27

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Digestão de DNA com enzimas de restrição As enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível.

As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica. Existem comercializadas perto de 100 enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma sequência única de nucleótidos.

As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo, EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E). espécie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd.

[edit] Exercício 1 – Extremidades e ligações Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):

Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT

Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?

A característica invulgar da enzima é a capacidade de reconhecer um palíndroma na sequência, ou seja, ambas as cadeias têm a mesma sequência de nucleótidos mas em orientações inversas. Exemplo: 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'

Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.

Bam HI : 5'- G|GATCC - 3' 3'- CCTAG|G - 5'

Hae II: 5'- GG|CC - 3' 3'- CC|GG - 5'

Eco RI: 5'- G|AATTC - 3' 3'- CTTAA|G - 5'

Bgl II: 5'- A|GATCT - 3' 3'- TCTAG|A - 5' É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?

Com a BamHI e com a Bgl II sim, mas com a EcoRI não é possivel. A enzima EcoRI reconhece um palíndroma diferente do da enzima BamHI, ou seja, quando ocorre o corte desta sequência, são formadas extremidades coesivas diferentes das criadas com a enzima BamHI. Assim, ao se tentarem ligar a sequências cortadas por enzimas de restrição diferentes, a ligação não ocorre. No entanto, quando cortada com a sequência Bgl II criam-se extremidades coesivas complementares com as criadas com a BamHI, o que permite que ocorra a ligação entre elas.

Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.

Os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com BamHI são maiores do que os fragmentos com Hae II. Existe menor probabilidade de encontrar a sequência de restrição da BamHI no genoma do que a sequência de restrição da enzima Hae II. Como a probabilidade é menor, a enzima corta menos vezes no genoma, originando fragmentos maiores.

[edit] Exercício 2 – Mapas de restrição As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html

A que correspondem as bandas azuis no gel?

No gel observam-se dois tipos de bandas: bandas azuis claro e bandas azuis escuro. As bandas azuis claro correspondem a bandas de azul de xilene, enquanto que as bandas azuis escuro correspondem a azul de bromofenol. Estes dois tipos de bandas permitem obter uma noção da localização dos fragmentos de DNA, durante o processo de electroforese, sem ser necessário recorrer à utilização de luz UV. Assim, são evitados determinados erros, como por exemplo, que o gel corra demasiado tempo.

Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?

Espera-se obter 5 fragmentos utilizando a PleI e 4 fragmentos com a BglI, visto que existem, respectivamente, 4 e 3 locais de restrição. Através da observação da imagem de electroforese, após ligar a luz UV, no caso da PleI, surgem 2 bandas, contudo, possuem larguras diferentes. No caso da enzima BglI surgem 3 bandas de tamanhos idênticos. Estes erros devem-se, provavelmente, a um tempo insuficiente de electroforose, ou uma baixa concentração de agarose no gel. Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

Quanto maior a concentração da agarose, menor vai ser o tamanho dos poros do gel. Moléculas com menor tamanho vão correr no gel mais rapidamente, distanciando-se mais do poço onde o DNA foi aplicado. Assim, a resolução da electroforese é maior, permitindo distingir fragmentos de tamanhos semelhantes.

Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA deve-se adicionar uma coluna na electroforese que corresponde a um marcador molecular.

Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.

Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?

Sim, porque na electroforese observamos 6 fragmentos, que advêm do corte da enzima EcoRI no genoma do bacteriófago lambda nos seus 5 locais de restrição.

Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

DNA lambda = 31,6*10^5 Dalton

1 dalton = 1,66*10^-27 gramas

1 dalton -- 1,66*10^-27 gramas 31,6*10^5 dalton -- x

x= 5,25*10^-21 gramas

Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

Fragmentos: 1- 21228 2- 4878 3- 5643 4- 7421 5- 5804 6- 3530

Sabendo que foi utilizado um total de um micrograma de DNA no gel e que o genoma do bateriófago lambda contêm 48510 pares de bases, então:

1a banda:

1 micrograma --- 48510 x      --- 21228

x = 0.438 microgramas

Última banda:

1 micrograma --- 48510 x      --- 3530 x = 0.073 microgramas

Assim, na primeira banda, existe 0.438 microgramas de DNA, enquanto que na última banda existe 0.073 microgramas de DNA.

Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:

DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000 DNA x HindIII = 5500 + 4500 DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500 Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.

Mapa de restrição com EcoRI: 5’__________________________|____________|_______________3’

5000pb			2000pb		 3000pb ou

5’__________________________|________________|___________3’

5000pb		    3000pb		2000pb

Mapa de restrição com HindIII: 5’__________________________|___________________________3’

5500pb			               4500pb ou

5’__________________________|___________________________3’

4500pb			               5500pb

Deste modo, consoante o tamanho dos fragmentos que foram obtidos pela restrição das 2 enzimas (5000, 3000, 1500 e 500 pb), e sobrepondo as diferentes possibilidades dos mapas de restrição das 2 enzimas, o único mapa de restrição possível é o seguinte: 5’__________________________|____|_______|________________3’	                   E    H       E        5000pb		     500pb 1500pb  3000pb

Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:

uma enzima de corte único;

BamHI    -    posição:  347                         sequência de reconhecimento:     g/gatcc EcoRI  -      posição: 414                          sequência de reconhecimento:    g/aattc

uma enzima com dois cortes;

AlwI    -     posições:  195,  351                     sequência de reconhecimento:  ggatc PleI    -     posições: 66, 184                        sequência de reconhecimento:   gagtc

uma enzima que não corta neste DNA.

BgIII - seq. de reconhecimento: A GATC T HindIII - seq.de reconhecimento:  A AGCT T

(ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA AAAAAAAAA)

[edit] Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações As variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense.

Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença.

O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.

Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.

Gene normal:

5’_______________|___________|___________|________________3’                   175pb 	201pb

Gene mutado:

5’_______________|_______________________|________________3’                    376pb (175+201)

Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.

O PCR é uma técnica que permite a amplificação da região onde a mutação se localiza nos pacientes portadores da doença. Após a reacção de PCR, podemos utilizar o material amplificado para detectar a presença da mutação através da digestão com enzimas de restrição, hibridização com oligonucleotídeos ou sequenciamento. Neste caso, após a amplificação do fragmento utilizando primers que flanqueiam o local da mutação, e faz-se a digestão com a enzima Ddel. Finalmente, podemos recorrer à electroforese para visualizar o resultado da digestão do DNA por esta enzima. Caso exista mutação (individuo homozigótico), a enzima não reconhece o local de corte e apenas se visualiza um fragmento, se não houver mutação (individuo homozigótico) a enzima corta e observam-se 2 fragmentos. Se o individuo for heterozigótico, observam-se 3 fragmentos, provenientes de um alelo normal e um alelo mutado.

Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).

Num individuo saudável, nenhum dos seus alelos possui a mutação. Deste modo, ao amplificar o DNA do gene da beta globina por PCR, na região que flanqueia a mutação, e depois de o submeter à digestão pela enzima de restrição Ddel, vão surgir no gel de electroforese 2 bandas, dado que esta enzima corta uma vez na zona amplificada pelos 2 primers. Num individuo heterozigótico, portador da doença, em que um dos alelos possui a doença, vão surgir 3 bandas no gel de electroforese. Aparecem então 2 bandas que correspondem aos fragmentos que derivam do corte da enzima Ddel, e uma 3ª banda que vai corresponder a um fragmento maior, que se forma devido à presença da mutação que altera o local de corte da enzima, fazendo com que não haja corte do DNA naquele local, que corresponde à soma das 2 bandas obtidas a partir do alelo normal. Num individuo doente, homozigótico, surge apenas 1 banda na electroforese, já que a mutação encontra-se presente em ambos os alelos, logo a enzima não reconhece o local de corte.

Normal  Heterozigótico Homozigótico (doente) _______	        _______		_______	_______	 		_______	_______


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