FCCT Biochemistry Lab:Courses:TrDNA

This is a working version of the Recombinant DNA Technology course Wiki in Slovenian language. Basic course information in English. ''Short URL of this page is http://trdna.notlong.com

=TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNA=

NOVO
[23.9.2009] Nova spletna stran tega predmeta je na wikiju FKKT, podatki s te strani pa bodo vedno bolj zastareli, zato ni smiselno, da jih res berete. Kar tja pojdite.

Odgovori na vprašanja
(1) Na konzultacijah se je pojavilo vprašanje, zakaj retrovirusi ne morejo okužiti celic, ki se ne delijo (poglavje o genskem zdravljenju). Problem je v tem, da pri celicah, ki se ne delijo, ne pride do integracije z reverzno transkriptazo prepisanega virusnega genoma v genom okužene celice. Obstajajo tri možne razlage, zakaj to ni možno. Po prvi naj bi bila integracijska mesta v normalnem kromatinu nedostopna, po drugi naj bi v procesu podvojevanja DNA in delitve celice integracijski kompleks lažje dostopal do tarčnih mest, po tretji pa naj bi celični proteini, ki se vežejo na DNA med podvojevanjem, omogočili sestavljenemu integracijskemu kompleksu usmerjen dostop do vključitvenih mest. Proces integracije retrovirusne DNA v genom gostiteljske celice je natančno razložen v članku v Trends in Genetics (2006).

(2) Pri predavanjih nisem dobro razložil postopka onkolize z adenovirusi. Za ilustracijo si oglejte slike v sklopu L2. Ključno za razumevanje je, da veste, da je protein p53 tumorski supresor, ki je v tumorskih celicah najpogosteje nefunkcionalen. Okužba zdravih celic (p53 deluje normalno) z divjim tipom adenovirusa povzroči od p53-odvisno apoptozo, ki pa se izrazi tako počasi, da se medtem virus še lahko namnoži. Za tako zakasnjeno sprožitev apoptoze mora priti do interakcije med virusnim proteinom E1B in celičnim p53. Če pripravimo viruse z delecijo gena E1B, potem zakasnitve apoptoze v zdravih celicah ne bo, kar pomeni, da se v zdravih celicah virus ne bo mogel razmnoževati. V tumorskih celicah pa protein p53 ni funkcionalen, torej do apoptoze ne more priti, zato se adenovirus lahko namnoži, celico uniči, hkrati pa namnoženi virusi lahko okužijo sosednje celice. O izkušnjah z adenovirusnimi in drugimi onkolitičnimi virusnimi preparati si lahko več preberete v kratkem članku iz Lanceta, o mehanizmu delovanja pa precej natančno v reviji Oncogene. Vedeti je treba, da je adenovirus treba injicirati čimbolj natančno v tumor, tako da je škoda za okoliške zdrave celice, ki do neke mere res odmrejo, kar najmanjša.

Teme po datumih v štud. letu 2008/09
(teme so opisane pod tabelo v predmetniku)

Predmetnik
oznake: MB...Glick & Pasternak: Molecular Biotechnology (strani se nanašajo na starejšo 2. izdajo, ki je tudi v CTK), PGM...Primrose, Twyman & Old (pomožni učbenik; številke so strani, ki obsegajo določeno temo): Principles of gene manipulation, 'Maniatis'...Sambrook&Russel: Molecular cloning. A laboratory manual. Razdelitev po 2-urnih sklopih in osnovna literatura: A1 Namen predmeta, potek predavanj; osnove tehnologije rekombinantne DNA, zgodovina [MB 3-12] (več kot malo tudi na WWW), zakonodaja (SI: Zakon o ravnanju z GSO; predpisi EU; konvencija o člov. pravicah v zvezi z biomedicino in protokol o prepovedi kloniranja človeških bitij); A2 Laboratorijski organizmi [MB 13-18]; varnost Slovenski portal biološke varnosti; ameriški standardi: navodila NIH

B1 Elektroforezne metode (nekatere osnove na straneh Colorado State University). Encimi v tehnologiji rekombinantne DNA [MB 45-51 + 'Maniatis', PGM 26-42] B2 Vektorji [MB 51-59; 68-74; PGM 43-84]. Reporterski geni pregled reporterskih sistemov v reviji The Scientist 7/2001).

C1 Sinteza cDNA, priprava knjižnic [MB 59-68; PGM 83-119]. Transformiranje celic [MB 74-75]. C2 Sinteza DNA in vitro. Različne izvedbe PCR. [MB 79-108; PGM 19-25]

D1 Hibridizacija, sonde – načini označevanja [MB 59-66 + označevanje sond]. Določanje nukleotidnega zaporedja [MB120-132]. D2  DNA-mikromreže sestavek v Wikipediji, na gene-chips.com in pregled (2005) v reviji The Scientist; gradivo za ameriške srednje šole.

E1  Ekspresijski sistemi - splošno (opisi nekaterih metod na straneh EMBL - deluje v programu Internet Explorer). E2  Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje; usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost in renaturacija ([MB 109-143 + renaturacije: kratek pregled; PGM 139-155).

F1  Izražanje v kvasovkah in nitastih glivah [MB 145-154; PGM 156-173]. F2  Izražanje v gojenih živalskih in človeških celicah [MB 154-169; PGM 174-220].

G1  Mutageneza – pristopi; proteinsko inženirstvo. [MB171-195; PGM 132-138] G2  Predstavitev na fagih ([MB122-124 + pregledni članek W.G.T. Willats, Plant Mol. Biol., 2002). Dvohibridni sistem kvasovk - nekaj podrobnosti; princip dvohibridnega sistema PPT in uporaba pri iskanju proteinov, ki interagirajo PPT - avtor Bruce Jenks, Univ. Nijmegen, Nizozemska.

H1  Forenzična genetika / prstni odtis DNA (glej tudi poglavje v Wikipediji, za začetek morda tudi sestavek na kemija.org). Predavala bo predvidoma prof. dr. Katja Drobnič s Centra za kriminalistično-tehnične preiskave MNZ. H2  DNA-diagnostika [MB206-224]. Uporaba TrDNA v sistematiki in ekologiji (teorija in preprost primer). Proizvodnja rekombinantnih reagentov [MB227-276].

I1  Molekularna biotehnologija: uporaba rekombinantnih organizmov [MB 277-309], uporaba biomase [MB 311-345]. I2  Rekomb. bakterije v agronomiji [MB 347-397]. Rekombinantna DNA v rastlinskih sistemih [MB227-276, PGM 221-246].

J1  Uporaba rastlin v molekularni biotehnologiji (MB 445-477; kratek poljudni uvod tudi na WWW). Gensko spremenjena hrana (dileme: glej novice nasprotnikov GSH na WWW). J2  Izvorne celice (uvod in osnovni pojmi na strani NIH; izvorne celice na Kimball's Biology Pages; poljudni članek Nejca Jelena o izvornih celicah in njihovi uporabi - na kemija.org: 1. del, 2. del). Transgenske živali [MB 479-505, PGM 247-273].

K1  Tehnologija izbijanja genov (splošen uvod na straneh revije The Scientist). Utišanje genov z RNAi (osnove v animaciji revije Nature Reviews Genetics - zahteva pripomoček FlashPlayer; Nobelova nagrada za fiziologijo 2006 - razlaga. Kloniranje sesalcev splošno, seznam doslej kloniranih sesalcev in poglavje o kloniranju živali na Wikipediji; povzetek v reviji Nature: 10 let po objavi članka o ovci Dolly). K2 Projekt Človekov genom posebna ševilka revije Science ob objavi zaporedja človekovega genoma, novica v reviji Nature in povezave). Določanje zaporedij drugih genomov genomski projekti na Wikipediji).

L1  Genomika – proteomika (o ~ómikah v reviji Nature; proteomika na Wikipediji). Farmakogenomika sestavek na NCBI). L2  Tehnologija rekombinante DNA v medicini. Gensko zdravljenje [MB555-590]. Aptameri na Wikipediji

M1  Patentiranje, dileme, možnosti. (MB 591-620; slovenska zakonodaja (v formatu PDF), evropska patentna konvencija). M2  Etika ter družbena sprejemljivost. Patentiranje v genetiki in Etični, sociološki in zakonodajni vidiki na straneh programa Človekov genom; Etična vprašanja v biotehnologiji; UNESCO: Svetovna deklaracija o človekovem genomu in človekovih pravicah).

N1-2  Novi pristopi v tehnologiji rekombinantne DNA (nove tehnike, reagenti in pristopi pri kloniranju in čiščenju rekomb. proteinov; pregled novih sistemov na trgu) O1  ponovitve, poglabljanje, odprta vprašanja O2  zaključni pisni izpit in zagovor __ *(za prebiranje WWW strani se morate prijaviti v BioMedNet, je pa zastonj in vam omogoča dostop do še več drugih virov in informacij s področja molekularne biologije in biomedicine).

'Maniatis': ''tako na kratko imenujemo laboratorijski priročnik, ki je bil pred leti številka 1 v laboratorijih, saj vsebuje osnovne razlage in veliko postopkov za delo. Pravi vir je: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. Obstaja tudi 3. izdaja. Ne poskušajte si te knjige izposoditi v knjižnicah, ker jo povsod rabijo v laboratorijih. Tudi kupovati je nima smisla, razen če nameravate odpreti lasten laboratorij. Enako uporabna in (ne)dostopna je '' rdeča knjiga ' ', uradno F.M. Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley &amp; Sons - trenutno 5 debelih map protokolov in razlag. '' Ker boste res rabili samo nekaj strani, se pri študiju tehničnih postopkov lahko oprete na kopije slik s predavanj, ki vam jih bom dal.

Stara izpitna vprašanja
(2002/03, 2. rok) 1. (3) Kaj pomenita pojma homologen in heterologen ekspresijski sistem? 2. (3) Katere so prednosti in slabosti izražanja genov v insektnih celicah v primerjavi z drugimi gostiteljskimi organizmi? 3. (2) Kakšno je skupno število baznih parov v genomu riža? 4. (9) Opiši vektor (čemu služijo posamezni zapisi in regije na vektorju)! Za katere gostiteljske organizme ga lahko uporabimo? Kako lahko induciramo izražanje rekombinantne sintetaze? (slike ni on-line, ker je iz nekega članka – šlo je za ekspresijski vektor za E. coli) 5. (4) Naštej 4 primere uporabe mestno-specifične mutageneze? 6. (3) Zakaj pride do zaustavitve podaljševanja verige pri dodatku terminatorjev v sekvenčni reakciji? 7. (6) V blatu ob jezeru Turkana so našli mumificirani trupli dveh osebkov, enega odraslega in enega otroka. Kako bi na osnovi njune DNA ugotovili, ali gre za starša z otrokom ali ne? 8. (4) Opiši postopek hibridizacije fragmentov genomske DNA E. coli! Sonda je že pripravljena in detekcija bo potekla po navodilih proizvajalca – pripraviti je treba samo genomsko DNA za analizo. 9. (6) Opiši princip delovanja dvohibridnega sistema na osnovi proteina Gal4! 10. (5) Kaj vse lahko usmerjeno spreminjamo pri sončnicah za večji hektarski donos in kvaliteto semen? 11. (4) Kaj pomeni oznaka His-tag, kje se pojavlja in katere so lastnosti rekombinantnih proteinov, ki vključujejo to oznako? 12. (5) Kako bi lahko detektirali točkovno mutacijo v genu za laktalbumin s pomočjo 3 začetnih oligonukleotidov in fluorescenčnim označevanjem produktov? 13. (3) Naštej 3 lastnosti episomskih vektorjev za kvasovke! 14. (3) Po katerem principu poteka ločevanje nastalih produktov pri avtomatskih sekvenatorjih DNA? 

Rezultati pisnega dela izpita
(tabela pripravljena za vnos podatkov)

Kriterij za ocene iz pisnega dela je: 56%-65% za 6, 66%-74% za 7, 75%-82% za 8, 83%-90% za 9, &gt;90% za 10. V sistem e-študent vpisujem tudi negativne ocene po kriteriju: 0%-11% za 1, 12%-23% za 2, 24%-34% za 3, 35%-45% za 4, 46%-55% za 5.

=
=====

Koristne povezave
 Kako čemu rečemo po slovensko? Terminološka komisija pri Slovenskem biokemijskem društvu Katedra za biokemijo Fakultete za kemijo in kem. tehnologijo Univerze v Ljubljani Razlage nekaterih osnovnih pojmov, novice, strani za študente in predavatelje s področja molekularne biologije, biotehnologije, tehnologije rekombinantne DNA: Access Excellence - tudi slikovno gradivo. Slovar biotehnoloških izrazov (vsi slovarji so v angleščini). Slovar genetskih izrazov</li> Slovar celične biologije;</li> Slovar biotehnologije in genetskega inženirstva (FAO)</li> </ul> Komentarji, vprašanja in odgovori: Na strokovna vprašanja bom poskušal odgovoriti na predavanjih, če pa niste moji študenti, pa na kratko tudi po e-pošti. Pišite mi tudi, če katera od povezav na tej strani ne deluje več ali če veste za kakšno drugo dobro povezavo, ki bi jo veljalo vključiti.