User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/04/27

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Digestão de DNA com enzimas de restrição
As enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível.

As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica. Existem comercializadas perto de 100 enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma sequência única de nucleótidos.

As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo, EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E). espécie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd.

Exercício 1 – Extremidades e ligações
Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):

Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT


 * 1) Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?

São sequências palindrómicas.


 * 1) Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.

Bam HI :---G GATCC-- ---CCTAG G---

Hae II: ---GG CC--

---CC    GG--

Eco RI: -G AATTC---

-CTTAA   G---

Bgl II: -A GATCT---

-TCTAG   A---


 * 1) É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?

Bam HI – sim

Eco RI – não

BgI II – sim


 * 1) Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.

Os fragmentos resultantes da digestão com Bam HI serão maiores, dado que a sequência de reconhecimento de Bam HI é maior, sendo a probabilidade de ocorrência é menor.

Exercício 2 – Mapas de restrição
As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html


 * 1) A que correspondem as bandas azuis no gel?

Correspondem a corantes da electroforese, permitem a correcta colocação da amostra no poço e também seguir a electroforese.


 * 1) Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?

Plel:

Esperados – 4

Observados – 3

BgII:

Esperados – 3

Observados – 3

A resolução da electroforese não permite separar fragmentos com um número reduzido de nucleótidos diferentes.


 * 1) Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

A diferente concentração de agarose faz variar o tamanho da malha do gel de agarose. Uma maior concentração de agarose permite uma separação mais eficiente de fragmentos que diferem num reduzido número de nucleótidos.


 * 1) Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Para determinar o tamanho dos fragmentos recorreria a um marcador de pesos moleculares e traçaria uma recta de calibração com o logaritmo do peso molecular. Assim, seria possível determinar o tamanho dos fragmentos em função da distância percorrida no gel.



Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.


 * 1) Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?

Como resultado da electroforese obtemos seis bandas e os tamanhos dos fragmentos sãos consistentes com os cinco locais de corte de enzima EcoRI, portanto pode corresponder a uma digestão com esta enzima.


 * 1) Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas:
 * 2) Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

As duas bandas têm igual número de moléculas de DNA.


 * 1) Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:
 * 1) DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000
 * 2) DNA x HindIII = 5500 + 4500
 * 3) DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500
 * 4) Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.

Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: (ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA AAAAAAAAA)
 * 1) uma enzima de corte único;
 * 2) uma enzima com dois cortes;
 * 3) uma enzima que não corta neste DNA.

Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações
As variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense.

Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença.

O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.
 * 1) Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.
 * 2) Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.
 * 3) Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).


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