User:Volker Gatterdam/Protokolle/Expression

=Expression von TycA & GrsA (M15 pQE60 pREP4)= 2 L Kolben mit je 0,5 L Medium 5 L Kolben mit je 1,25 L Medium
 * LB-Medium autoklavieren und über Nacht bei 250 rpm und 37°C schütteln zum Sauerstoff anreichern und vorwärmen.

Zellwachstum
bei 0,5 L 1000 µL amp 50K --> amp 100 (100 µg/mL) 250 µL kan 50K --> kan 25 (25 µg/mL)
 * Antibiotika hinzugeben

bei 1,25 L 625 µL kan 50K --> kan 25 (25 µg/mL)
 * 1:100 Übernachtzellkultur hinzugeben
 * Zellen bei 250 rpm und 37°C bis zu OD600 = 0,3-0,4 wachsen lassen dann Temperatur schon auf 30°C langsam erniedrigen.

Induktion

 * Ab OD600 = 0,6 Temperatur auf 25°C erniedrigen und Induktion mit 100-300 µL IPTG (0,1-0,3 mM)
 * 4 Stunden expremieren (Alternativ über Nacht bei 18°C mit 0,1 mM IPTG)
 * Zellen runter fugen (6000 rpm für 20 min)
 * etwa in 20 mL 3% HEPES B resuspendieren und wegfrieren (-20°C)

Analytik
SDS-PAGE


 * 1 mL Zellsuspension zentrifugieren und Pellet lösen in
 * 75 µL TE-Puffer
 * 25µL 4xSDS Puffer

10 min bei 95°C aufkochen und anschließend bei 13.000 rpm für 3 min zentrifugieren. Es werden 15 µL des Überstandes pro PAGE-Tasche aufgetragen. Einstellungen für das Netzteil sind 10 mA und 300V.

Quellen

 * Protein Expression and Purification (OpenWetWare)