User:Gabriela Santos/Notebook/GabrielaSantos BIOMOL/2010/05/11

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Entry title
A utilização de enzimas de restrição e vectores de DNA permite criar moléculas de DNA recombinantes e cloná-las em bactérias.
 * Clonagem molecular

As bactérias transformadas com uma única molécula de DNA plasmídeo podem ser isoladas em placas de petri graças ao gene de resistência presente no vector.,

Em seguida, podem ser multiplicadas em culturas líquidas de pequena, média ou grande escala e utilizadas como "fábricas" de DNA, de onde se pode purificar o vector plasmídico, separando-o do DNA genómico e proteínas bacterianas pelo método da lise alcalina.

Consultar página original das imagens

O DNA presente em cada colónia bacteriana pode ser analizado por digestão com enzimas de restrição, para confirmar que contém a sequência desejada.

O DNA assim purificado pode ser introduzido noutras células (por exemplo, em células humanas) para, por exemplo, expressar a proteína codificada pelo gene clonado.

[edit] Questões 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo.

Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

Um organismo humano contém 10^13 celulas e cada célula contem 2 cópias de um gene, podemos dizer que no total o organismo possui: 2*10^13 copias do gene. Uma bactéria pode ter 700 cópias de um plasmideo o que implica que pode conter 700 copias do gene (isto se os plasmideos forem todos iguais). Em 1L de cultura de baterias teríamos: 5*10^9*1000*700=35*10^14 copias do gene.

2. Considere os seguintes vectores:

2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique. Escolheria o vector B porque é o que contem um promotor, permitindo a iniciaçao do processo de transcrição.

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:

Escolhia o fragmento que contem a extremidade BamHI e EcoRI. A escolha de um fragmento com extremidades diferentes apesar se ser mais dispendioso para o laboratório é mais seguro para obter resultados fiaveis. A utilização de duas enzimas de restrição diferentes permite com que depois da abertura do vector com estas enzimas não há o perigo de o vector se fechar sobre si mesmo. alem disso permite que o fragmento ao ser introduzido no vector ocorra na orientação correcta, nao podendo ser colocado ao contrário (visto que as extremidades de ligação sao diferentes.

Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura. 3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Deve-se introduzir a sequencia que queremos clonar no local de policlonagem, na zona da Bam HI, visto ser a única que nos permite colocar a sequência por possuir as mesmas extremidades coesivas. No entanto, coloca-se o problema mencionado na resposta 2.2., em que há a possibilidade de o fragmento ser colocado ao contrário.

3.2 Como procederia para resolver o problema? Para resolver o problema, introduzia vários vectores na célula e analisava. Para ter a certeza de que o fragmento é introduzido no sentido correcto, procedia ao corte da sequência com a enzima Hpn1 e EcoRI e, através de uma electroforese, via qual é o tamanho dos fragmentos, uma vez que os fragmentos obtidos têm tamanhos diferentes e permitem constatar se a sequência está presente e no sentido correcto. Se o fragmento estiver bem inserido, na electroforese observa-se uma banda com 800 pb e outra com 4500 pb. Se o fragmento estiver invertido, observa-se uma banda com 120 pb e outra com 5510 pb. Se o fragmento não estiver inserido, apenas observa-se uma banda com 4700.

3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

Sim, porque se obtiveram 2 fragmentos, um com ~800 pb e outro com ~4500 pb na 3ªcoluna da electroforese, que advêm do corte com as enzimas Eco RI e Kpn I. Assim podemos dizer que não existiram erros na introdução do fragmento no vector e que ele foi colocado na orientação correcta.

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