User:Ana Isabel F. Simoes/Notebook/Ana Simoes-biomol/2010/03/23

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Questões
Que características deve ter um primer de PCR?

Um primer corresponde a um fragemnto de DNA de 15-30 nucleotidos com um conteudo elevado em GC(40-60%). Numa reacção de PCR existem dois primers(Forward e Reverse) ligados à terminação 3' complementar a cada uma das cadeia simples de DNA. A ligação dos primers À cadeia ocorre a temperaturas entre 50 e 65ºC.

Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

O primer específico de gene deve ser utilizado quando pretendemos obter fragmentos de DNA específicos do gene que está a ser estudado. Por exemplo, no caso de uma mutação génica este método facilmente nos permite identificar essa alteração nos genes. Este método contudo não é muito adequado quando pretendemos sequenciar diferentes fragmentos de DNA. O primer oligo-dT é util quando se pretende transcrever fragmentos de mRNA com cauda de poli-A, não sendo adequado quando se quer obter fragmentos de DNA de outras regiões sem esta terminação. O primer Random tem a vantagem de poder ser utilizado para transcrever diferentes regiões e tipos de RNA uma vez que são utilizados diferentes primers permitindo-nos sequenciar a região terminal da cadeia que pela utilização de um unico primer seria difici. Possui como desvantagem o facto de não ser específico para quando queremos transcrever sequências específicas e de transcrever demasiados fragmentos de RNA.

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Para identificar uma mutação no gene Beta-globina, recorreria a uma amplificação das sequências que contêm mutação tanto no caso da mãe como do pai. De seguida separaria os fragmentos por electroforese em gel de agarose e sequenciaria para confirmar a existência da mutação.

Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Realizaria um RT PCR a partir do RNA das células que expressam o gene da beta-globina para obter o RNAm da beta-globina e deste modo investigar-se-ia a presença ou ausência de expressão deste gene.


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