User:Gaston Paris:Notebook/Mutantes CheY

=Objetivo=

Construir las cepas mutantes de CheY, BAB1_0100 en B. abortus 2308 y clonar los genes correspondientes en pTrcHis. Evaluar la infección en macrófagos en condiciones de luz y oscuridad.

=Estrategia=

Mutantes
Se amplificaran las regiones 5' y 3' de cada gen para luego purificarlas y realizar una PCR recombinante con los fragmentos. El fragmento recombinante se digerirá y purificará por gel para luego clonarlo en el vector pK18mobSacB.

Se utilizarán los siguientes oligos:

5CheyFWD-BamHI y 5CheyREV fragmento 5' de CheY

3CheyFWD y 3CheyREV-SalI fragmento 3' de CheY

5Ba_0100FWD-BamHI y 5BAB_0100REV fragmento 5' de BAB1_0100

3BAB_0100FWD y 3BAB_0100REV-SalI fragmento 3' de BAB1_0100

La presencia del inserto correcto se verificará por colony PCR y digestión.

Los clones adecuados se transformaran en E.coli S-17 para luego movilizarlos a Brucella abortus 2308 por conjugación. Los clones simple recombinantes se seleccionaran por resistencia a Kanamicina, Ampicilina y ácido nalidíxico.

Los dobles recombinantes se seleccionaran por crecimiento en presencia de sacarosa.

El knock-out se confirmará por colony PCR y secuencia



Clonado Proteínas
Se amplificaran los genes CheY de B. abortus (BAB1_0099) y el regulador transcripcional río arriba de él (BAB1_0100). Los fragmentos amplificados se digeriran y purificaran por gel de agarosa para luego ligarlos al vector pTrcHisB (Invitrogen)

Se utilizaran los siguientes oligos:

CheY_FWD_Nhe y BAB1_0099_reverse para el gen CheY.

BAB_0100FWD_Nhe y BAB_0100REV_XhoI para el regulador transcripcional.

=Resultados=

Martes 30/10/07
Transformé 80 &mu;l de DH5&alpha; con 2 &mu;l de pK18mobSacB que me enviaron de Japón. Luego de recuperar en SOC, se inocularon 25 ml de SOB, que se pusieron a crecer a 37°C O.N.

Miércoles 31/10/07
Se cosecharon 6 ml de cultivo de pK18monSacB por duplicado y se realizaron minipreps con el kit Qiagen utilizando el doble de volumen indicado en el protocolo estándar. Se corrieron alícuotas en un gel de agarosa para confirmar la cantidad y calidad. Se guardan a -20°C.



Jueves 1/11/07
Llegaron los oligos. Los diluyo a 10 &mu;M y preparo el protocolo para amplificar.

Viernes 2/11/07
Prepare reacciones de PCR de acuerdo a la siguiente receta. A cada tubo se agregaron los oligos y luego 33,7 &mu;l de la siguiente mix:

Las condiciones de ciclado en la PCR Genius fueron:


 * 5' a 94°C
 * Hot Start a 80°C (se agregó 1 &mu;l de pfu a cada tubo)
 * Seguido de 35 ciclos de:
 * 30" a 93°C
 * 1' a 55°C
 * 1' a 68°C
 * Y 10' a 72°C de extensión final

Lo siguiente es la referencia:

Lunes 5/11/07
Se corrió un gel con 20 &mu;l de cada PCR 1 a 6 y se cortaron las bandas correspondientes

Martes 6/11/07
Las bandas cortadas ayer se purificaron por Illustra GFX PCR (GE). Se guardan congeladas hasta mañana. 

Miércoles 7/11/07
Corrí un gel con 5 &mu;l de cada purificación.



Jueves 08/11/07
PCR recombinante de armado de la estrategia de deleción de CheY y BAB1_0100.

Las condiciones de la PCR genius fueron las siguientes:


 * 5' a 94°C
 * Hot Start a 80°C (se agregó 1 &mu;l de pfu a cada tubo)
 * Seguido de 35 ciclos de:
 * 30" a 93°C
 * 1' a 55°C
 * 2' a 68°C
 * y 10' a 72°C de extensión final

Las PCR 5 y 6 del 7/11/07 se extrajeron una vez con cloroformo y se precipitaron con 0,7 volumenes de isopropanol y 0,3M de acetato de sodio. 

Viernes 09/11/07
Corrí un gel con 10 &mu;l de la PCR recombinante. Aparecen las bandas esperadas de 1 Kb.

Extraigo una vez con cloroformo y precipito con isopropanol + 0,3 M acetato de sodio.

Digestiones de los fragmentos precipitados:
 * Para clonar los genes Chey y BAB_0100 con NheI-XhoI, junto con el vector pTrcHisB
 * Para clonar los fragmentos recombinantes con BamHI-SalI, junto con el vector pK18mobSacB

Se incubó a 37°C 2-3hs. Luego se congelaron.

Lunes 12/11/07
Corrí un gel con las digestiones del viernes y las PCR de CheY y BAB1_0100.

Corté las bandas y las purifiqué por Qiaquick.

Martes 13/11/07
Corrí 3 μl de cada purificación en un gel de agarosa. Cuantificación:
 * pK18mobSacB 20 ng/μL
 * ΔCheY       10 ng/μL
 * ΔBAB_0100   80 ng/μL
 * pTHB        50 ng/μL
 * CheY y BAB_0100 considero 10 ng/μL porque se fueron del gel.

Ligación

Las ligaciones las guardé congeladas hasta que regreso de SAIB 

Miércoles 27/11/07
Transformé 50 μL de células DH5α electrocompetentes con 5 μL de cada ligación. La recuperé con 1 mL de SOC y plaquee 200 μL en placas de LB ampicilina 100 ng/mL y kamicina 25 ng/mL.

Jueves 28/11/07
Las placas parecen estar correctas. El clonado en pTrcHisB funcionó correctamente y en pK18mobSacB está en el mismo nivel que el control 

Lunes 03/12/07
Corrí una colony PCR tomando 5 colonias de las placas de la ligación.

MIX

Se agregaron 20 μL a cada tubo en el cual se adicionó una colonia con un tip. El tipo se introdujo en 2 mL de LB con 100 ng/mL de ampicilina o 25 ng/mL de kanamicina y se incubó a 37°C

Las condiciones de la PCR genius fueron las siguientes: 
 * 5' a 94°C
 * Seguido de 35 ciclos de:
 * 30" a 93°C
 * 30" a 55°C
 * 45" a 72°C
 * y 10' a 72°C de extensión final

Viernes 14/12/07
Comprobé las presencia de insertos en minipreps de los clones positivos. Solamente los clones en pTrcHisB con positivos y no los pK18mobSacB. Renombro los plásmidos: pTrcHisB-CheY a pGP0100 y pTrcHisB-BAB1_0100 a pGP0101.

Lunes 17/12/07
Retomo el clonado en pK18mobSacB. Voy a rehacer las PCRs recombinantes, posterior digestión y ligación.

Utilizo la enzima Pfx de Invitrogen para repetir la PCR recombinante. Comienzo con los fragmentos amplificados y purificados del 2/11/07 nombrado PCR1, 2, 3 y 4.

Protocolo PCR


Las condiciones en la PCR Genius fueron las siguientes: 35 ciclos de: seguido de un ciclo:
 * 5' a 94°C
 * Hot Start a 80°C
 * 30" a 93°C
 * 1' a 55°C
 * 1' a 68°C
 * 10' a 68°C

Precipitación
A las reacciones les agregué 150 μL de H2O y realicé una extracción con cloroformo. Centrifugué 5 min a máxima velocidad y tome la fase superior, a la cual le adicioné 0,1 volúmenes de AcNa 3M y 0,7 volúmenes de Isopropanol. Centrifugué 25 min a máxima velocidad. Lavé el pellet con etanol 70% y deje secar.

Digestión
Repetí las digestiones como el 9/11/07. Incluí dos tubos control con el plásmido pTrcHisB 1 h 37°C

Martes 18/12/07
Corro un gel con las digestiones de ayer y purifico las bandas de pK18, ΔCheY y ΔBAB1_0100 por Qiaquick.