Etchevers:Notebook/Embryos/2009/07/17

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Angélique a fait ce protocole sur des coupes de peau embryonnaire/foetale humaine suivantes:

0600137B - 29 (12sd)

0600137E -77

R1059 - 74 (7sd)

e0600262 - 20 (38sd)

090007A - 23 (12sd)

Celles-ci sont adjacentes a celles que j'ai envoyees a Sandrine pour c-kit.

1.	Déparaffiner les coupes 5 um : 2x 5’ xylène (or toluene or Histoclear) 2x 2’ 100% EtOH 2’ 95% EtOH 2’ chacun: 70%, 50%, 30% EtOH Passage dans de l’eau Passage PBS

2.	30’ dans 0,5 M chlorure d’ammonium dans du PBS (amidimation des aldehydes libres) – ou glycine 50 mM à la place.

3.	Faire 3 lavages de 5’ dans du PBS + 0,1% Tween-20 (PBT)

4.	Démasquage d’antigènes: faire bouiller 0.01M Na citrate pH 6 dans de l’eau.

5.	Mettre les lames dans le bain pour 20’. Refroidir doucement puis remettre PBS TA

6.	Bloquer à 10% sérum de veau foetal dans du PBT pour 30’ sans lamelle, sous parafilm éventuellement.

7.	Sortir le Progold+DAPI du congélateur

8.	Anti-tyrosinase 1:100 dans 2 % serum/PBS (se trouve a 4ºC dans tiroir de droite)


 * 75 ul par lame en chambre humide sous lamelle ou Parafilm


 * Incuber 1 à 2 hours TA.

9.	Rincer 5x PBS pendant 5’

10.	Deuxième anticorps: anti-IgG2a-555 (1:200) sous lamelles/Parafilm pendant 1 heure TA: 5 ul anticorps pour 1 ml PBS

11.	Rincer 5x PBS pendant 5’.

12.	Monter les lames au Progold + DAPI. Ne pas mettre de vernis avant lundi. Garder au noir a température ambiante le reste de l’après-midi (16h - 17h30) puis ranger au frigo.


 * Heather 12:51, 16 July 2009 (EDT):