User:Volker Gatterdam/Protokolle/Proteinaufreinigung

=Proteinaufreinigung=

French Press
3 x pressen


 * zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20min
 * dekantieren zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20 min

Ni-NTA
Ni-NTA 0,75 ml/min (max 1,5) 0,1 cm/min

Vorbereitung
Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min 10 min H2O 10 min 100% HEPES B 10 min 3% HEPES B

Probe
Flussgeschwindigkeit: 0,75 mL/min Papiervorschub: 0,1 cm/min


 * Probe auf Ni-NTA Säule auftragen
 * Mit 3% HEPES B spülen bis unspezifische Proteine entfernt sind.
 * Anschließend mit Gradienten eluieren

Reinigen
Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min 20 min 100% HEPES B 20 min H2O 10 min 20% EtOH

Analytik
Bradfordtest 10µL Probe 100µL Bradford

SDS-Gel 12µL Probe 4µL 4xSDS Probenpuffer 13.000 rpm 3min 95°C für 5 min

7,5% Gel 300 V 40 mA ~1 h

Hi-Trap
GeFi-Puffer

2 ml/min 1,5 mL Probe pro Säule

TECHNICAL SPECIFICATIONS HiTrap™ Desalting Column


 * HiTrap™

Gelfiltration
Säulenvolumen 320 mL

Reinigen
Flussgeschwindigkeit: 2 mL/min 1/2-1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH (200 mL) 1-2 Säulenvolumen H2O 1-2 Säulenvolumen 20% EtOH