User:Gabriela Santos/Notebook/GabrielaSantos BIOMOL/2010/03/16

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Sequenciação de DNA

[edit] Introdução As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing

Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing

Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.

[edit] Questões O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? A cadeia molde (3' para 5'), primers, DNA polimerase, ddNTP's (didesoxirribonucleotidos trifosfatados) em baixas concentraçoes, dNTPs (desoxirribonucleosídeos trifosfatados) em altas concentraçoes, marcadores de fluorescencia um para cada tipo de nucletido

Que cadeia é sequenciada? A cadeia sequenciada é de 5' para 3' sendo a cadeia a qual se inicia com o primer que adicionamos.

Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação? é uma sequenciaçao por terminação pois caracteriza-se pelo uso de didesoxinucleótidos (ddNTPs) que uma vez incorporados nas cadeias de DNA crescente impedem a sua extensão pela DNA polimerases, pois não possuem a terminação grupo 3’-OH.

Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo? O metodo de sequenciaçao de Sanger é um metodo probabilistico. Em cada reacçao, um ddNTP é incorporado aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando nesse caso a terminação da polimerização. O tamanho de cada fragmento é por isso determinado pela posição na cadeia filha na qual é incorporado o ddNTP. Para que isto aconteça, as proporções entre a quantidade de dNTPs e ddNTPs devem estar bem reguladas, ou seja, os ddNTPs tem que estar em concentrações muito mais baixas que os dNTPs.

A densidade do sinal vai diminuindo, à medida q a polimerase vai avançando na sequencia da cadeia filha pois a enzima vai conseguir produzir menor quantidade de moléculas, quanto maior for o fragmento, pois menos fragmentos grandes sao produzidos, logo os picos que correspondem a fragmentos maiores são menores. Os picos que desaparecem podem estar relacionados com o esgotar de um dos dNTP na mistura.

Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? Observa-se que a altura dos picos é cada vez menor assimc om a densidade do sinal. A DNA polimerase consegue produzir em maior quantidade e mais rapidamente fragmentos com um numero de bases menor do que fragmentos com elevado numero de bases, daí que altura dos picos seja menor á medida que a sequenciaçao decorre. A densidade do sinal tambem vai diminuindo à medida que o numero de nucletidos na seuquencia vai aumentando. Isto deve-se à capacidade de resolucao dos fragmentos de DNA na tecnica de electroforese, ou seja, a separaçao de fragmentos com numero de bases muito pequeno ou muito grande é muito dificil, dai que aparecam no esquema picos sobrepostos. A resoluçao é dificil porque a separaçao dos diferentes fragmentos e de apenas um nucletido.

O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

Devemos utilizar 2 primers, separadamente, um que sequencia de 5' para 3' e ou outro no sentido contrario, de modo que consigamos cobrir a sequencia completa (No entanto assim so se pode obter no maximo 100 em cada extremidade. Restam 3000bp no meio). Devemos tambem utilizar, em reacções de sequenciação diferentes, diferentes primers, localizados em locais diferentes  da cadeia a sequenciar e espaçados de 600-800 bp cada, de forma a que as sequencias obtidas sejam sobrepostas.

Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

verdeA AzulC PretG VermT Individuo 1- TCG TGT TCT ATG ATC ATG AGA GTC GCC G Individuo 2- TCG TGT TCT ATG ATC/G (dois picos sobrepostos) ATG AGA GTC GCC G

Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder? Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo? Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique. Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

[edit] Para pensar Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?

O fragmento de DNA a sequenciar estava inserido num plasmidio de sequencia conhecida. Ou então eram-lhe colocadas sequencias conhecidas nas extremidades por ligação de adaptadores, aos quais depois se ligavam os primers.

Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?

Utilização de milhoes de primers que permitiram ir entrando cada vez mais nas sequencias dos cromossomas e obtendo, de cada vez, sequencias sobrepostas que depois podiam ser ligadas umas as outras e produzir uma sequencia continua.

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