User:Iolanda S. O. Santos/Notebook/Caderno de Apontamentos/2010/03/09

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Exercício TP2
A sequência do genoma humano apresentada abaixo provém do cromossoma 11 e contém o gene da beta-globina:
 * Gene e mRNA

CACACATATATATATATATTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCT TAGAACCGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGA GATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAACTCTTCCACTTTTAGTGCATCAACTTCT TATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTAC GTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATA TCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTAC GGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAG GGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGAC ACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGT TACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGG TTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTG ATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGA CCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAA GGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACC TTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTAT GGGACGCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGATAAGTAA CAGGGTACAGTTTAGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGT TTCTTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCTCC GCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAATATCTCTGAGATACATT AAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATT TGCATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATACATATTTA TGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAATATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAAT TTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCT TTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAAT TTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAG AGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGG CTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAG CTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGG CTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCT TGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAA GGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTAT TTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGAATGTGG

A seguinte sequência corresponde ao mRNA da beta-globina:

ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC AGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT CCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA AAAAAAAAA

- Compare as duas sequências (utilize o alinhamento blast online)

- Que diferenças encontra e qual a sua origem?

Existem 3 regiões que foram transcritas (3 Blast Hits). Há espaços que corresponderão a intrões que são removidos aquando do splicing (pre-mRNA ao nível dos spliceossomas é sujeito à acção dos snRNA's que reconhecem as zonas de splicing; zonas de intrões que deverão ser removidas e zonas de exões que deverão ser retidas). Posteriormente, através do splicing alternativo os exões são "unidos". Outra diferença: mRNA contém sequência que não está contida no genoma, que resulta da adição de nucleótidos para a estabilização do próprio mRNA (cauda AAAA... chega a ter 200 Adeninas).

Onde se inicia a transcrição e porquê?

A transcrição inicia-se no nucleotido 546 do DNA. Na sequência do genoma da beta-globina podemos encontrar antes desta zona de iniciação da transcrição, a sequência ATAAA. Esta corresponderá ao TATA Box incompleto (parte do promotor, 26 a 31 nucleotidos antes da sequência alvo de transcrição), mas suficiente para a ocorrência deste processo no nosso sistema biológico.

Experimente traduzir ambas as sequências (tradução online). O que sucede e que implicações tem para o processo de expressão génica?

Há zonas que correspondem a UTR's (untranslated region) que regulam a transcrição. Um UTR antes do 1º exão e um UTR no último exão (3º exão).

Se estivesse a comparar a sequência de um gene de E. coli e seu transcrito, que diferenças esperaria encontrar? E se fosse de S. cerevisiae (levedura)?

Tanto na E. Coli como na levedura, entre o genoma e o seu transcrito as diferenças são mínimas. Nos organismos procariotas (E. coli) 90% do DNA é codificante. Genes policistrónicos (proteinas traduzidas em sucessão; agrupamentos génicos).

Levedura - modelo eucariota mais próximo do Homem - ausência de intrões

As bactérias e leveduras podem ser crescidas facilmente em grandes quantidades, o que permite a utilização destes organismos como "fábricas" de produção de proteínas. Se pretender utilizar estes organismos para produzir uma proteína humana, que aspectos terá de ter em consideração?

Usar DNA complementar. Este é formado a partir do mRNA (que já sofreu splicing); acção da transcriptase reversa. Logo, aquando da aplicação de processos de engenharia genética conseguimos obter a protéina desejada.

Sequenciação de DNA Introdução Estas sequências foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing

Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing

Questões Considere o seguinte resultado de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?

O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?

Se a sequênciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?

Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?


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