User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/16

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TP3-Sequenciação de DNA
Pelo método de Sanger usamos nucleótidos, dideoxinucleótidos marcados radioactiva ou fluorescentemente, uma cadeia molde, um primer e uma DNA polimerase.
 * O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

É sequenciada a cadeia complementar por adição de nucleótidos ao primer, logo a cadeia sintetizada será igual á cadeia que é complementar daquela á qual o primer se liga.
 * Que cadeia é sequenciada?

Neste método são utilizados didNTP's, nucleótidos que não têm um grupo hidroxilo na posição 3', logo não há a formação da ligação fosofodiéster impedindo a progressão da elongação e fazendo com que a polimerase se desligue da cadeia molde.
 * Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

Nao termina no primeiro nucleótido pois podee ter o grupo 3'-OH.
 * Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

No inicio do electroferograma os picos não estão bem definidos, isto porque na a electroforese anterior a leitura a migração das sequencias mais pequenas é muito semelhante sendo complicado diferenciá-las. No final do electroferogram também existem cada vez picos mais pequenos e menos definidos isto porque a quantidade de moléculas de maiores dimensões com didNTP no final é menor e torna também a diferneciaçaõ entre os fragmentos.
 * Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?



Fragmentar o segmento em pedaços mais pequenos e de tamanhos diferentes e fazer a sequenciação de cada um deles em separado, tentando assim evitar os efeitos do tamanho na electroforese.
 * O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?


 * Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

Indivíduo 1 TCGTGTTCTATGATcATGAGAGTCGCCG

Indivíduo 2 TCGTGTTCTATGATgATGAGAGTCGCCG TCGTGTTCTATGATcATGAGAGTCGCCG

O indivíduo 1 é homozigótico e o 2 heterozigótico, isto pode ver se pelo sobreposição de cores no segundo electroferograma e na diminuição da intensidade do do pico.

O mRNA deveria ser convertido em cDNA primeiro, depois ter um primer para se ligar à sequência complementar aquela que queremos sequenciar.
 * Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?


 * Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.


 * 1) Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?

Considerando as mutações T->A no nucleótido 462 (mãe) e T->G no nucleótido 732 (pai): - MÃE - O pico correspondente ao nucleótido 462 teria uma sobreposição de vermelho e verde; o pico correspondente ao nucleótido 732 seria vermelho. -PAI - O pico correspondente ao nucleótido 732 teria uma sobreposição de vermelho e preto; o pico correspondente ao nucleótido 462 seria vermelho. -Maria- O pico correspondente ao nucleótido 462 teria uma sobreposição de vermelho e verde; o pico correspondente ao nucleótido 732 teria uma sobreposição vermelho e preto.


 * 1) Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.


 * Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

Para pensar

 * Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?

As primeiras sequenciações foram realizadas recorrendo a reacções de síntese do DNA. Em quatro tubos eram colocados pedaços de DNA e nucleótidos, em cada um dos quatro tubos era colocado um nucleótido radioactivo e três normais (ex:num tubo era colocado guanina radioactiva e adenina, citosina e timina normais) e depois corria-se uma electroforese em que em cada poço se colocava o conteúdo de um tubo, os fragmentos que incorporassem nucleótidos radioactivos a sua síntese acabaria aí e assim na electroforese era possível separá-los com base nos seus tamanhos e depois era só juntar a sequência final.


 * Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?

A estratégia terá sido quebrar os cromossomas em fragmentos de menores dimensões, sequenciar cada um deles individualmente e depois juntar todas as pequenas sequenciações até se ter a sequência completa.