BIOMOL LCS/2010:TP 3

Introdução
As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing

Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing

Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.

Questões

 * O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?


 * Que cadeia é sequenciada?


 * Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?


 * Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?


 * Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?




 * O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?


 * Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?




 * Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?


 * Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.


 * 1) Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?
 * 2) Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.


 * Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

Para pensar

 * Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?


 * Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?