User:Filipa Ribeiro C. Lucas/Notebook/Filipa Lucas/2010/04/27

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Exercício 1 – Extremidades e ligações
Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT

Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?

As enzimas de restrição são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas. A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em sequências alvo específica de DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Assim uma enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição.

Porém, a caractrística invulgar da sequência de reconhecimento destas enzimas está relacionada com as "pontas adesivas", os seja o facto de serem palindromas: a sua sequência pode ser lida tanto da direita para a esquerda como da esquerda para a direita, o que significa que ambos os filamentos têm a mesma seqüência de nucleotídeos mas em orientação de polaridade inversa. Assim, Enzimas de restrição diferentes cortam em sequências palindromicas diferentes

Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.

Bam HI:

G---GATCC 5' CCTAC---G 3'

Hae II:

GG---CC 5' CC---GG 3

Eco RI:

G---AATTC 5' CTTAA---G 3'

Bgl II:

A---GATCT 5' TCTAG---A 3'

'''É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?'''

É possível ligar uma molécula de DNA cortada por Bam HI a outra cortada por Bam HI e Bg III, mas não é possível com Eco RI.

'''Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.'''

Maioritariamente, os fragmentos resultantes de digestão de DNA genómico humano por Bam HI serão maiores que os fragmentos resultantes da digestão por Hae II, porque a sequência de reconhecimento da Bam HI é maior, por isso, a probabilidade de encontrar uma sequência GGATCC no genoma é menor que GGCC, levando a menos cortes e fragmentos Bam HI com maior tamanho.

Exercício 2 – Mapas de restrição
A que correspondem as bandas azuis no gel?

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas num determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial e neste caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. As bandas azuis no gel correspondem a corantes de electroforese. Por um lado, as bandas azul-claro são bandas de azul de xilene, por outro lado, as bandas de azul escuro são bandas de azul de bromofenol. O uso destes corantes permite ver a colocação da amostra nos poço e o decorrer desta técnica ao longo do tempo, evitando erros (deixar correr o gel durante um período de tempo excessivo).

'''Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?'''

Com PleI espera-se obter 4 fragmentos e observam-se 3 (causa: falhas de resolução, ou seja devido a terem tamanhos praticamente idênticos estão sobrepostos). Com BgII espera-se e observam-se 3 fragmentos.

Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

A agarose é um polissacarídeo, e forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de agarose, têm-se uma diferença no gradiente de separação. Assim, a sua concentração está relacionada com o tamanho da malha do gel (logo, quanto maior for a concentração, mais eficiente será a separação, sendo possível distinguir-se fragmentos com tamanhos idênticos).

Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Usando um marcador de pesos moleculares, o que permitiria fazer uma recta de calibração (com o logaritmo do peso molecular dos fragmentos em função do tempo de retenção). Através deste método, o estudo da recta obtida permite descobrir de forma precisa o tamanho do fragmento em função da distância percorrida no gel.

Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.

''' Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? '''

Sim, são visíveis 6 fragmentos, resultantes do corte de uma molécula de DNA em 5 locais.

Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas:

Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

Dado que o DNA lambda tem 31.6x10^5 daltons e que 1 dalton = 1.66x10^-27 gramas, o DNA lambda terá aproximadamente 10^-21 gramas = 10^-15 microgramas. Em 1 micrograma de DNA há aproximadamente 10^15 moléculas de DNA.

Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

Na primeira banda há 0.44 microgramas:

48510 - 1μg 21227 -- x

Na última há 0.073 microgramas:

48510 1 μg 3530 -- x

Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII: DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000 DNA x HindIII = 5500 + 4500 DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500

Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.

nt0; nt5000 - Corte pela EcoRI; nt5500 - Corte pela HindIII; nt8000 - Corte pela EcoRI; nt10000.

>---|---|---|--< 5000                  -- E   500--      -H  1500          --- E  3000---

'''Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: ''' uma enzima de corte único: Bam HI

uma enzima com dois cortes: Dpn I

uma enzima que não corta neste DNA: Hind III

Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações
O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. ''' Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. '''

Ddel-1_________Ddel-2____________Ddel-3 (gene normal)
 * ________________X______________________| (gene mutado)

Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.

Através da técnica de PCR é possível amplificar o DNA mutado. Posteriormente a este passo, procederia a um tratamento do DNA com a enzima de restrição Dde e por fim usaria a técnica de electroforese em gel.

Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).

Indivíduo saudável: 2 bandas Indivíduo Portador: 3 bandas Indivíduo Doente: 1 banda